Id1參與胃癌血管生成的作用及可能機制的研究.pdf

1、腫瘤的發(fā)生與維持離不開新生血管的形成，腫瘤細胞的侵襲更依賴于腫瘤內新生血管向遠處轉移。尋找一個合適新生血管的靶標，是治療腫瘤的關鍵。目前認為分化抑制因子1（Id1）是一種準原癌基因的侯選分子和促血管生成因子，多項研究提示其表達在腫瘤的血管生成過程中可能起著重要作用。 Id 是螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）轉錄因子亞家族的一個成員，通過影響其下游分子的轉錄而發(fā)揮作用，但其參與血管生成的具體機制尚不明確。 基質金屬蛋白酶（MMPs

2、）是細胞外基質（ECM）和基底膜重塑所必需的條件，目前認為MMPs 并不僅僅只降解ECM 成分，其更多的是作用于血管的發(fā)生。MMPs 幾乎在所有的人類腫瘤中廣泛而大量表達，大量研究證實MMPs 的高水平表達與腫瘤的侵襲和/或轉移能力以及不良預后有關，并在腫瘤的血管生成中起著決定性作用。有報道提出，在Id1 基因敲除的鼠胚胎纖維母細胞的培養(yǎng)上清中MMP-2 的活性下降。本研究著重探討了Id1 通過調控MMPs 發(fā)揮促胃癌血管生成的作用。

3、 環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，激發(fā)血管生成是其促癌機制之一，但其調節(jié)機制尚不明確。我實驗室的前期工作提示，COX-2 抑制劑可以下調Id1 的表達。本實驗又進一步研究了COX-2 對Id1 在胃癌血管生成作用中的調控。 [目的] （1）研究Id1 與MMPs 在胃癌血管生成中的關系及相互作用； （2）探討在胃癌血管生成中COX-2 對I

4、d1 的調控。 [方法] （一）Id1 通過調控MMPs 發(fā)揮促胃癌血管生成的作用： （1）采用免疫組織化學方法檢測Id1 及MMP-2、-9 在胃癌組織中的表達； （2）采用RT-PCR 和Western blot 方法檢測轉染Id1 特異性小干擾RNA（Id1-siRNA）的SGC7901 細胞中MMP-2 和MMP-9 的表達，并用明膠酶譜實驗進一步檢測Id1-siRNA 細胞中MMP-2、-9 的

5、活性；（3）采用免疫組織化學方法檢測Id1-siRNA 細胞和空載體轉染細胞在裸鼠體內成瘤組織中MMP-2、-9 的表達； （4）利用MMPs ELISA 試劑盒檢測不同處理組細胞上清中MMP-2、-9 的含量； （5）收集外源性高表達Id1 的胃癌細胞培養(yǎng)上清，作為條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），利用Transwell 小室觀察內皮細胞遷移能力和管狀形成的情況，再加入MMP-2、-9 的中和性抗體，觀察

6、其對上述變化的影響； （6）利用雙熒光素酶報告基因實驗檢測在胃癌細胞中抑制Id1 后，MMP-2、-9 啟動子活性的變化。 （二）COX-2 對Id1 在胃癌血管生成作用中的調控： （1）建立高表達COX-2 和表達COX-2 特異性siRNA 的胃癌SGC7901 細胞系； （2）通過Western blot 和RT-PCR 方法檢測兩種亞細胞系中Id1 的表達； （3）采用ELISA 方法分析

7、兩種細胞上清中VEGF 的表達差異； （4）通過MTT 實驗分析兩種細胞亞系的上清對HUVECs 體外增殖的影響，并在SGC7901/COX-2 中抑制Id1 后觀察培養(yǎng)上清中VEGF 的變化以及對HUVECs增殖的影響； （5）裸鼠成瘤實驗觀察SGC7901/COX-2/Id1-siRNA 轉染細胞的成瘤性、腫瘤新生微血管密度（MVD）及Id1 的表達。 [結果] （1）免疫組織化學結果顯示，在胃癌組織

8、中Id1 和MMP-2、9 呈共表達； （2）成功建立表達特異性Id1-siRNA細胞系，Western blot和RT-PCR結果提示不同克隆的轉染效率不同； （3）轉染Id1-siRNA的SGC7901 細胞中MMP-2、-9 的蛋白及mRNA表達水平均低于對照組； （4）明膠酶譜實驗顯示，Id1-siRNA細胞組的MMP-2、-9 的活性較對照細胞組下降； （5）Id1– siRNA細胞處理后的裸鼠

9、體內成瘤組織中MMP-2、-9 的表達均顯著降低； （6）在SGC7901/Id1-siRNA細胞條件培養(yǎng)基中，HUVECs管狀形成和增殖能力明顯降低，在其中加入MMP-2、-9 的中和性抗體后抑制作用被逆轉； （7）根據(jù)生物信息學網(wǎng)站(http://dbtss.hgc.jp/)提供的啟動子序列（-2000~+200），我們克隆了MMP-2、-9 的啟動子并構建入PGL-3basic報告基因載體，瞬時轉染SGC7901細

10、胞和Id1 表達降低的SGC7901/Id1-siRNA細胞?？梢詸z測出在Id1 表達降低的細胞中，MMP-2、-9 的轉錄活性均降低了2~2.5 倍； （8）成功建立高表達COX-2 以及表達特異性COX-2-siRNA的穩(wěn)定克隆，并鑒定了不同克隆的轉染效率； （9）高表達COX-2 的胃癌SGC7901 細胞中Id1 的蛋白及mRNA表達水平增高，而轉染COX-2-siRNA的SGC7901 細胞中Id1 的表達則均

11、低于對照組； （10）COX-2 高表達的SGC7901/COX-2 細胞上清中VEGF的蛋白含量較對照組高，而SGC7901/COX-2-siRNA細胞上清中VEGF的蛋白含量較對照組低； （11）在SGC7901/COX-2 細胞條件培養(yǎng)基中，HUVECs生長較對照組加快； 在SGC7901/COX-2-siRNA細胞條件培養(yǎng)基中，HUVECs生長較對照組減慢； （12）在SGC7901/COX-2

12、中抑制Id1 后，培養(yǎng)上清中VEGF的含量下降，且對HUVECs促進增殖的作用被逆轉；（13）裸鼠成瘤試驗顯示抑制Id1 后SGC7901/COX-2 細胞成瘤性降低，成瘤組織的微血管密度下降，Id1 的表達也下調。 [結論] （1）Id1 和MMP-2、MMP-9 在胃癌組織中表達上調； （2）Id1 可正性調控MMP-2、-9 的表達水平，抑制Id1 的表達可減弱MMP-2、-9 的表達； （3）Id

13、1 通過對MMP-2、-9 的正性調控促進內皮細胞體外增殖、遷移和管狀形成的能力，并通過激活錄促進MMP-2、-9 的表達和活性； （4）COX-2可上調SGC7901 細胞中Id1 的表達，并通過此途徑影響內皮細胞的體外增殖能力。 本研究提示，在胃癌發(fā)生發(fā)展中Id1 可能通過調控MMP-2、-9 的表達及活性促進血管生成，并且在胃癌中高表達的COX-2 可能參與調控了Id1 介導的促血管生成作用，因此Id1 有可能成為