香菇多糖聯(lián)合丙肝核酸疫苗誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)的研究.pdf

1、第一部分、丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3（NS3）DNA疫苗的制備與鑒定。 目的：大量制備丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3（NS3）DNA疫苗，并進(jìn)行定量及定性分析，為進(jìn)一步研究其免疫活性奠定基礎(chǔ)。 方法：將pcDNA3.1-HCV/NS3轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌HB101，克隆后挑取單個菌落擴(kuò)增，用超純質(zhì)粒大量快速提取試劑盒提取pcDNA3.1-HCV/NS3，提取物分別進(jìn)行核酸定量檢測和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 結(jié)果：本試驗成功的轉(zhuǎn)

2、化pcDNA3.1-HCV/NS于大腸桿菌中，鋪平皿溫育16h后有較多的單菌落生長。擴(kuò)增提取產(chǎn)物經(jīng)核酸定量檢測，濃度在1.5μg/μl－2μg/μl范圍內(nèi)，純度均接近1.8，因免疫小鼠所需要的DNA濃度為1μg/μl，所以提取的DNA在濃度和純度上符合要求，另將擴(kuò)增提取產(chǎn)物雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實擴(kuò)增的質(zhì)粒DNA包含目的基因NS3片段，分子量為1.8Kb。 結(jié)論：本實驗成功制備了用于免疫動物的HCV/NS3 DNA疫苗，為進(jìn)

3、一步研究其免疫活性奠定了基礎(chǔ)。 第二部分、香菇多糖作為免疫佐劑對丙肝病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3（NS3）體液免疫效果的影響。 目的：探討中藥香菇多糖（LNT）作為免疫佐劑對HCV/NS3核酸疫苗體液免疫效果的影響。 方法：HCV-NS3核酸疫苗肌注免疫BALB/c小鼠（100μg/只），10天后加強免疫一次，同時灌胃給予高(1mg/ml)、中(0.5mg/ml)、低(0.1mg/ml)三種劑量的香菇多糖，于末次免疫后第1、

4、3、5周分別采集小鼠尾血，分離收集血清凍存。用HCV/NS3抗原多肽包被酶標(biāo)板，采用間接酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法檢測小鼠血清特異性IgG抗體水平。并采用ELISA方法檢測血清中細(xì)胞因子IL-4和IFN-g分泌水平。 結(jié)果：二次免疫后1周各組免疫小鼠血清中均產(chǎn)生了不同水平的抗體，以中劑量LNT為佐劑的免疫組在各時間點產(chǎn)生的特異性IgG水平最為顯著，而且隨著時間的增加，中劑量LNT為佐劑的免疫組和單獨免疫核酸疫苗組的特異性I

5、gG水平呈現(xiàn)出上升的趨勢，而以高劑量和低劑量的LNT為佐劑免疫組的抗體水平隨時間變化不大；中劑量香菇多糖為佐劑免疫組產(chǎn)生的特異性抗體水平較單獨免疫核酸疫苗組在各時間點均有顯著性提高（P<0.05）。細(xì)胞因子分析顯示以不同劑量香菇多糖作為佐劑的免疫組較之單獨免疫核酸疫苗組IFN-γ的分泌增加，其中中劑量的香菇多糖聯(lián)合HCV/NS3核酸疫苗組產(chǎn)生IFN-γ的水平較之單獨使用核酸疫苗組，差異非常顯著（P<0.01）。而IL-4水平各組間無明顯

6、差異（P＞0.05）。 結(jié)論：通過二次肌注免疫HCV/NS3核酸疫苗，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗NS3抗原的特異性IgG抗體，而且隨著時間的延長，特異性抗體水平也隨之升高。中劑量的香菇多糖為佐劑能夠增強HCV/NS3核酸疫苗誘導(dǎo)的特異性體液免疫反應(yīng)。香菇多糖能夠刺激Th1類細(xì)胞因子IFN-γ分泌，而對Th2類細(xì)胞因子IL-4的分泌未明顯影響。 第三部分、香菇多糖作為佐劑對丙肝病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3（NS3）細(xì)胞免疫效果的影響。

7、目的：探討中藥香菇多糖（LNT）聯(lián)合丙型肝炎病毒（HCV）非結(jié)構(gòu)蛋白NS3核酸疫苗誘導(dǎo)NS3抗原特異性細(xì)胞免疫作用。 方法：將不同劑量的香菇多糖與HCV/NS3質(zhì)粒（100mg/只），采用初次加強免疫法聯(lián)合免疫BALB/c小鼠。第二次免疫10天后取小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，與NS3多肽抗原共同孵育作為效應(yīng)細(xì)胞。另培養(yǎng)NS3抗原致敏的P815細(xì)胞作為靶細(xì)胞。采用MTT法分別檢測NS3抗原特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)和細(xì)胞毒T細(xì)胞特異性殺傷

8、反應(yīng)（CTL）。 結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)中劑量和低劑量香菇多糖與NS3 質(zhì)粒聯(lián)用明顯增強NS3抗原特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)（P<0.05）。高劑量及中劑量香菇多糖與HCV/NS3核酸疫苗聯(lián)合應(yīng)用，在效靶細(xì)胞比為50:1和25:1時，可誘導(dǎo)更強NS3抗原特異性CTL反應(yīng)，與單獨免疫NS3 質(zhì)粒相比有顯著性差異（P<0.05）。而低劑量的香菇多糖佐劑免疫組的CTL殺傷率與單獨使用核酸疫苗組相比沒有明顯差異?？偟内厔菔请S著效靶細(xì)胞比值（E/T）的