黑質(zhì)氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體KCC2和NKCC1參與肝性腦病致運(yùn)動(dòng)障礙及其機(jī)制的研究.pdf

1、肝性腦?。℉E）是排除其它已知腦部疾病，由肝功能嚴(yán)重不足引起的神經(jīng)功能紊亂綜合癥，其臨床癥狀表現(xiàn)為注意力不集中、睡眠模式變化、肌共濟(jì)失調(diào)致木僵、暈迷等。盡管經(jīng)過幾十年的不懈研究，肝性腦病的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。因此，對(duì)該領(lǐng)域的研究具有十分重要的意義。
　　在人類對(duì)疾病的探索進(jìn)程中，動(dòng)物模型的應(yīng)用極大地推動(dòng)著研究的進(jìn)展。硫代乙酰胺（TAA）誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物為制備急性肝衰竭性肝性腦?。ˋ型HE）模型的公認(rèn)方法。目前，文獻(xiàn)中TAA總量波動(dòng)

2、范圍較大（200～1200mg/kg），對(duì)誘導(dǎo)A型HE的劑量沒有明確報(bào)道；TAA劑量與HE癥狀的量效關(guān)系尚未達(dá)成共識(shí)。文獻(xiàn)中多以大鼠或兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，所以對(duì)TAA誘導(dǎo)小鼠HE模型的研究十分必要。
　　肝性腦病誘致運(yùn)動(dòng)功能障礙的機(jī)制仍不清楚。研究表明肝性腦病致運(yùn)動(dòng)功能變化與“基底神經(jīng)節(jié)—額前皮質(zhì)”的神經(jīng)傳導(dǎo)通路的異常有關(guān)。由基底神經(jīng)節(jié)發(fā)出的運(yùn)動(dòng)信號(hào)受到黑質(zhì)網(wǎng)狀部（SNr）的調(diào)控，且SNr內(nèi)富含γ-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元。在神經(jīng)系

3、統(tǒng)發(fā)育早期，未成熟神經(jīng)元內(nèi)濃度較高的氯離子外流，導(dǎo)致GABAA受體介導(dǎo)的膜電位反應(yīng)多為去極化。在神經(jīng)系統(tǒng)，氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)中KCC2和NKCC1對(duì)Cl-平衡的調(diào)控極為重要，是決定GABA傳遞由抑制性向興奮性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。但黑質(zhì)氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體KCC2和NKCC1是否與肝性腦病致運(yùn)動(dòng)功能障礙有聯(lián)系，目前尚未見報(bào)道。
　　本研究擬通過觀察TAA致HE小鼠肝臟和腦功能變化，尋找TAA的合適劑量和理想的觀察指標(biāo)；并觀察HE小鼠黑質(zhì)氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)體

4、KCC2和NKCC1的表達(dá)水平及神經(jīng)元氯離子濃度的變化，旨在探討這組功能相反的氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體是否參與了肝性腦病致運(yùn)動(dòng)功能障礙及其機(jī)制。
　　首先，設(shè)立4個(gè)TAA劑量組，分別以200、250、300、400mg/(kg·d)劑量的TAA隔24h行腹腔注射，共3次，建立不同劑量TAA致小鼠HE的動(dòng)物模型，正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，每隔24h觀察各組生存率變化，第4天進(jìn)行腦功能評(píng)分、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字實(shí)驗(yàn)，第5天后觀察其血氨和肝功指標(biāo)

5、。
　　其次，以上面得到的合適劑量TAA隔24h行腹腔注射（3次）建立TAA致小鼠HE的動(dòng)物模型，正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水。模型建立成功后，利用Real-time RT-PCR和Western blot觀察KCC2和NKCC1的mRNA和蛋白在造模后第1天、第4天和第7天的表達(dá)變化，同時(shí)利用MQAE氯成像方法觀察黑質(zhì)神經(jīng)元氯離子濃度的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.不同劑量的TAA致小鼠存活率差異，400mg/(

6、kg·d)致小鼠存活率過低（31.6％）；
　　2.不同劑量TAA致小鼠腦功能評(píng)分、總路程、中央滯留時(shí)間和開臂滯留時(shí)間百分比顯著低于對(duì)照組，但開臂進(jìn)入次數(shù)百分比與對(duì)照組無(wú)顯著差異；
　　3.不同劑量TAA致小鼠血氨、AST和ALT水平顯著低于對(duì)照組，且各組之間存在顯著差異；
　　4.Real-time RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示黑質(zhì)NKCC1 mRNA和蛋白在造模后第1天、第4天和第7天表達(dá)上調(diào)，但

7、KCC2 mRNA和蛋白在造模后第1天、第4天和第7天表達(dá)下調(diào)；
　　5.MQAE氯成像結(jié)果顯示肝性腦病模型黑質(zhì)神經(jīng)元氯離子濃度較對(duì)照組顯著升高。
　　上述結(jié)果表明：
　　1.300mg/(kg·d)劑量TAA隔日腹腔注射3次為誘導(dǎo)小鼠A型HE模型的適宜劑量和方法；
　　2.TAA誘導(dǎo)A型HE小鼠腦功能異常，伴有自發(fā)活動(dòng)減少和焦慮情緒，腦功能評(píng)分、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字實(shí)驗(yàn)可用于評(píng)估腦功能的變化；
　　3.TA