雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架預(yù)防再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架的制備及相關(guān)特性研究
　　目的
　　制備雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架，并對(duì)其機(jī)械性能、堅(jiān)韌性、藥物釋放特點(diǎn)及生物相容性能進(jìn)行檢測(cè)。
　　方法
　　1、采用層層靜電自組裝法制備殼聚糖/肝素/CD34(CS/HP/CD34)抗體涂層，然后通過噴涂法制備PLGA/雷帕霉素藥物涂層，最后進(jìn)行支架組裝。
　　2、通過電鏡及光學(xué)顯微鏡觀察支架的物理性能，包括表面形貌，彎曲性

2、能，膨脹性能等，電鏡觀察涂層生物相容性，并對(duì)支架所載藥物進(jìn)行體外釋放測(cè)定。
　　結(jié)果
　　1、成功制備雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架，并對(duì)其物理性能和所載藥物釋放特點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，其各項(xiàng)觀察指標(biāo)符合支架制備基本要求，彎曲、壓握及球囊擴(kuò)張后涂層覆蓋均勻無開裂;通過電鏡觀察支架表面未見血小板聚集或偽足形成，涂層具有良好的生物相容性。
　　2、支架所載雷帕霉素釋放曲線呈線性釋放，一定程度克服了市面上同類支架爆發(fā)性釋放的特點(diǎn)，持

3、續(xù)觀察60d仍能檢測(cè)到藥物濃度。
　　結(jié)論
　　所制雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架符合冠脈植入支架制作工藝的基本要求，同時(shí)具備良好的物理性能及生物相容性，所載抗增殖藥物可持續(xù)線性釋放。
　　第二部分:雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架捕獲干細(xì)胞及其特性的研究
　　目的
　　在已對(duì)所制雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架機(jī)械性能、藥物釋放特點(diǎn)及生物相容性能研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)所設(shè)計(jì)支架捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞能力及其所捕獲

4、內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化特征進(jìn)行研究。
　　方法
　　1、通過掃描電鏡及間接免疫熒光觀察所制支架體外捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞情況及其分化特征。
　　2、通過熒光顯微鏡觀察兔耳實(shí)驗(yàn)捕獲內(nèi)皮祖細(xì)胞情況及支架片段的內(nèi)皮化程度。
　　結(jié)果
　　1、體外模擬內(nèi)皮祖細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)電鏡觀察:CD34抗體涂層可捕獲有直徑6-8μm左右的紡錘狀細(xì)胞，24h時(shí)細(xì)胞變得充盈飽滿。所捕獲細(xì)胞具有內(nèi)皮祖細(xì)胞的外形特征。間接免疫熒光觀察CD34抗體支架表

5、面可見大量VEGFR-2陽性細(xì)胞黏附的紅色熒光斑點(diǎn)。
　　2、兔耳動(dòng)脈內(nèi)皮祖細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)免疫熒光觀察見抗體涂層支架植入后24h支架大部分被血管內(nèi)皮細(xì)胞所覆蓋，48h達(dá)到完全覆蓋，未見細(xì)胞異常聚集。
　　結(jié)論
　　1、所制雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架能特異性快速捕獲外周血液中的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，其抗體與基礎(chǔ)涂層靜電結(jié)合牢固，具備良好的耐沖刷性能。
　　2、所制支架植入后48h即可完成血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，實(shí)現(xiàn)了支架快

6、速內(nèi)皮化，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)。
　　第三部分:動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架的有效性和安全性
　　目的
　　應(yīng)用小型豬冠脈損傷模型考察雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架預(yù)防ISR的有效性和安全性。
　　方法
　　1、應(yīng)用小型豬冠脈損傷模型將所制雷帕霉素支架(SES)、CD34抗體支架(GS)和雷帕霉素/CD34抗體支架(HCASES)分別隨機(jī)植入小型豬的左、右冠狀動(dòng)脈，取術(shù)后1h，12h，2

7、4h，2d，3d，7d，14d，28d，2m靜脈血觀察藥代動(dòng)力學(xué)特征。
　　2、14d，1m，3m，6m隨訪造影觀察支架輸送的性能，支架內(nèi)血栓及再狹窄情況。
　　3、術(shù)后14d，1m時(shí)間點(diǎn)經(jīng)電鏡掃描觀察早期支架內(nèi)皮覆蓋情況。
　　4、術(shù)后1m，3m，6m時(shí)間點(diǎn)通過病理形態(tài)學(xué)及半定量病理積分觀察內(nèi)皮化程度，炎癥情況及內(nèi)膜增生程度。
　　結(jié)果
　　1、各組支架具有良好的柔順性，X線下可視，全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置入順利，

8、無意外死亡。SES及HCASES組支架雷帕霉素釋放藥物濃度在1.55-2.36ng/ml，2m時(shí)仍可檢測(cè)。
　　2、各組支架間早期內(nèi)皮化程度存在差異，SES組支架內(nèi)皮覆蓋程度弱于GS及HCASES組支架。在支架置入14d時(shí)，GS及HCASES組可見梭型內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，相對(duì)排列規(guī)則，SES組內(nèi)皮覆蓋不均勻，細(xì)胞間連接不緊密。1m時(shí)GS及HCASES組內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋完整，排列規(guī)則;SES組細(xì)胞輪廓不規(guī)整且細(xì)胞排列紊亂，見小圓形的炎癥細(xì)胞。

9、
　　3、病理切片形態(tài)學(xué)及計(jì)算機(jī)測(cè)量:在1m，3m，6m時(shí)間點(diǎn)SES及HCASES組較GS組管腔面積增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但SES組與HCASES組間LA差異不明顯(P＞0.05)。1m，3m，6m時(shí)間點(diǎn)觀察SES及HCASES組較GS組新生內(nèi)膜面積及厚度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但SES組與HCASES組間差異不明顯(P＞0.05)。同樣SES及HCASES組較GS組狹窄率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、(P＜0.05)，但SES組與HCASES組間狹窄率對(duì)比差異不明顯(P＞0.05)。
　　4、病理學(xué)積分半定量測(cè)量顯示:損傷積分中SES，GS及HCASES各組支架14d及1m時(shí)間點(diǎn)損傷積分無明顯差異，3m及6m時(shí)間點(diǎn)SES組損傷積分較GS組及HCASES組略高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。比較SES，GS及HCASES各組14d、1m、3m和6m時(shí)間點(diǎn)內(nèi)皮化情況，支架植入后14d，1m時(shí)GS組及HCASES支架組內(nèi)皮化分

11、數(shù)較SES支架組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值＜0.05）;3m時(shí)間點(diǎn)觀察各組內(nèi)皮化基本完全，GS組及HCASES支架組內(nèi)皮化分?jǐn)?shù)較SES支架組略高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，6m時(shí)間點(diǎn)觀察各組內(nèi)皮化完全，各組間內(nèi)皮化程度無差異。炎癥積分情況:比較SES，GS及HCASES各組1m、3m和6m時(shí)間點(diǎn)支架周圍炎癥細(xì)胞浸潤情況可見植入后1m為炎癥反應(yīng)最顯著時(shí)期，其中SES組炎癥反應(yīng)最重，HCASES組次之，炎癥反應(yīng)最輕為GS組，差異有統(tǒng)

12、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。至3m及6m時(shí)間點(diǎn)觀察，三組間炎癥反應(yīng)差異不顯著(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1、通過小型豬冠脈損傷模型14d-6m隨訪評(píng)價(jià)所制雷帕霉素聯(lián)合CD34抗體復(fù)合支架的有效性和安全性可行。
　　2、各組支架間早期（14d及1m時(shí)）SES組支架內(nèi)皮覆蓋程度弱于GS及HCASES組，3m各組間內(nèi)皮覆蓋程度差異不顯著，6m時(shí)各組間內(nèi)皮化分?jǐn)?shù)無差異。
　　3、在1m，3m，6m時(shí)間點(diǎn)SES及HCA

13、SES組管腔面積大于GS組，SES及HCASES組新生內(nèi)膜面積及厚度均低于GS組，SES及HCASES組狹窄率低于GS組。1m時(shí)SES組炎癥反應(yīng)最嚴(yán)重，HCASES組次之，炎癥反應(yīng)最輕為GS組，至3m及6m時(shí)三組間炎癥反應(yīng)差異不顯著。
　　4、所制HCASES支架的殼聚糖/肝素/CD34抗體涂層能在植入后14d可完成內(nèi)皮覆蓋，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù);PLGA/雷帕霉素涂層可以抑制增殖并降低炎性反應(yīng)，無支架內(nèi)再狹窄，生物相容性良好，為進(jìn)一