草魚與3中脊椎動物MHCIα基因的克隆及其多態(tài)性比較.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）是存在于脊椎動物特定染色體上、呈高度多態(tài)性的一組基因群。其中，MHC I類分子由α鏈和β2m微球蛋白組成。α鏈呈現(xiàn)高度多態(tài)性，包括胞外段結(jié)構(gòu)域（α1、α2和α3）、跨膜區(qū)（TM）和胞漿區(qū)（CY）。α1與α2區(qū)域構(gòu)成的肽結(jié)合區(qū)（PBR）能與抗原多肽結(jié)合，由此誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。MHC I類分子的多態(tài)性引起結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，從而導(dǎo)致機(jī)

2、體對特定病原體抵抗力的差異。因此，研究MHC I分子α鏈的多態(tài)性特征有助于揭示分子進(jìn)化規(guī)律和免疫防御機(jī)制。本文主要闡述低等脊椎動物草魚（Ctenopharyngodon idellus, Ctid）MHC Iα基因結(jié)構(gòu)特征和多態(tài)性規(guī)律，并與脊椎動物中的小鼠、牛和雞進(jìn)行分析比較。
　　首先，抽提草魚三個個體的血液總RNA，經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增Ctid-MHC Iα基因，連接pMD18–T載體后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，

3、每個個體挑選20個陽性克隆送公司測序。其次，使用生物信息學(xué)軟件分析Ctid-MHC Iα基因結(jié)構(gòu)和多態(tài)性特征，并與脊椎動物中小鼠、牛和雞MHC Iα基因多態(tài)性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，克隆到大小約為1027bp的Ctid-MHC Iα基因片段，測序獲得了54條cDNA序列。草魚單個個體存在1–3種MHC Iα基因型，共篩選出5條Ctid-MHC Iα基因型序列，上傳至 GeneBank數(shù)據(jù)庫，獲得了相應(yīng)的基因序列登錄號（KF831073–KF

4、831077）。同時，獲得了小鼠（KF831063–KF831067）、牛（KF831068–KF831072）和雞（KF274027–KF274031）各5條MHC Iα基因序列登錄號。序列分析表明，Ctid-MHC Iα基因共編碼332個氨基酸（aa），分別對應(yīng)21個aa的信號肽，88個aa的α1區(qū)域，90個aa的α2區(qū)域，91個aa的α3區(qū)域和42個aa的TM/CY區(qū)域。Ctid-MHC Iα分子存在豐富的遺傳多樣性，所編碼的5個

5、區(qū)域中共存在150個氨基酸變異位點(diǎn)，其中有102個變異位點(diǎn)分布在α1和α2區(qū)域。多態(tài)性分析顯示，PBR區(qū)域共有16個氨基酸多態(tài)性位點(diǎn)（Wu–Kabat得分≥4），9個分布在α1區(qū)域，7個分布在α2區(qū)域，其中有4個峰值較高的多態(tài)性位點(diǎn)（Wu–Kabat分值≥8）分別位于第55、77、80和125位氨基酸殘基。11個多態(tài)性氨基酸位點(diǎn)位于PBR空間結(jié)構(gòu)的α螺旋或β折疊上，處于抗原遞呈的關(guān)鍵部位。此外，Ctid-MHC Iα基因錯義替換率（dN

6、）和同義替換率（dS）的比值（R）小于1，推測其分子演化方式受自然環(huán)境的負(fù)向選擇作用，而其他脊椎動物均為正向。進(jìn)化樹分析表明，Ctid-MHC Iα分子與其他脊椎動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，單獨(dú)構(gòu)成一大分支，且個體間繼續(xù)分化為不同的亞支，個體差異不明顯。
　　綜上所述，草魚與小鼠、牛、雞MHC Iα分子均具有高度多態(tài)性特征，α1和α2區(qū)域是多態(tài)性的主要富集區(qū)。四個物種 PBR的空間結(jié)構(gòu)相似，多態(tài)性氨基酸殘基主要分布在抗原遞呈的關(guān)鍵部位α螺旋