COXⅦa在中老年男子部分雄激素缺乏綜合征中的作用及機(jī)理研究.pdf

1、中老年男性隨著年齡的增長(zhǎng)雄激素水平逐漸下降,并出現(xiàn)倦怠、乏力、抑郁、失眠、情緒波動(dòng)、易怒、性欲減退、勃起功能障礙、體重減輕和骨質(zhì)疏松等一系列臨床癥狀,這一現(xiàn)象被稱為中老年男子部分雄激素缺乏綜合征(partial androgen deficiency of the aging male,PADAM)。PADAM和許多疾病有關(guān),如心血管疾病、糖尿病等,老年人群因衰老引發(fā)的各種疾病發(fā)病率逐年增高,嚴(yán)重影響中老年男性的身體健康和生活質(zhì)量。

2、r>　　 第一部分大鼠睪丸COXⅦa及類固醇合成酶和急性調(diào)節(jié)蛋白的加齡變化
　　 目的:探討大鼠出生后不同發(fā)育階段睪丸組織COXⅦa及睪酮合成酶和急性調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)變化并確定其與睪酮濃度的相關(guān)性。
　　 方法:
　　 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選用出生后1周齡、3周齡、5周齡、3月齡和24月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠,每年齡組6只(1周齡組為12只);
　　 2睪酮測(cè)定:化學(xué)發(fā)光方法測(cè)定血清總睪酮水平,批內(nèi)和批間變異系數(shù)分

3、別為2.2％-2.4％和3.4％-4.7％;
　　 3 RT-PCR方法檢測(cè)各年齡組睪丸組織COXⅦa、3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StARmRNA變化;
　　 4 western blotting、免疫組化法檢測(cè)各年齡組睪丸組織COXⅦa、3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StAR蛋白表達(dá)變化和定位。
　　 結(jié)論:
　　 1不同年齡大鼠睪丸組織COXⅦa表達(dá)存在差異,老年鼠

4、表達(dá)高于青年鼠,且與血清睪酮濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示COXⅦa與睪酮合成有關(guān),可能參與了PADAM的發(fā)生;
　　 2不同年齡大鼠睪丸組織3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StAR表達(dá)存在差異,3月齡組和5周齡組高于1周齡組、3周齡組和24月齡組;
　　 3 COXⅦa蛋白表達(dá)與3β-HSD、17β-HSD和P450scc蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān),提示COXⅦa可能通過上述類固醇合成酶調(diào)控睪酮合成,似乎與急性調(diào)節(jié)蛋白無關(guān)

5、。
　　 第二部分 COXⅦa對(duì)Leydig細(xì)胞睪酮合成能力影響的體外研究
　　 目的:1構(gòu)建pEGFP-N1-COXⅦa重組質(zhì)粒并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的3月齡大鼠Leydig細(xì)胞,探討COXⅦa過表達(dá)對(duì)睪酮合成能力的影響;
　　 2應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制COXⅦa在Leydig細(xì)胞中的表達(dá),探討COXⅦa抑制對(duì)睪酮合成能力的影響。
　　 方法:
　　 1大鼠睪丸Leydig細(xì)胞原代培養(yǎng)和鑒定:根據(jù)王

6、曉云等的差速貼壁方法稍加改進(jìn),分離純化Leydig細(xì)胞,3β-羥基類固醇脫氫酶化學(xué)染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞純度,0.4％臺(tái)盼藍(lán)溶液檢查細(xì)胞活力;
　　 2 pEGFP-N1-COXⅦa質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及細(xì)胞功能檢測(cè)
　　 2.1構(gòu)建pGM-T-COXⅦa克隆質(zhì)粒:設(shè)計(jì)擴(kuò)增COXⅦa的DNA引物,在上、下游引物的5’端分別加入BglⅡ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基,從24月齡大鼠睪丸組織中RT-PCR擴(kuò)增COXⅦa基

7、因,將擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收、經(jīng)BglⅡ和EcoRⅠ酶切獲得COXⅦa基因片段;用T4連接酶將具有相同BglⅠ和EcoRⅠ粘性末端的pGM-T載體和COXⅦa基因連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂板,挑克隆,搖菌抽質(zhì)粒后酶切鑒定含COXⅦa基因的克隆,大量擴(kuò)增該克隆后抽質(zhì)粒,得到pGM-T-COXⅦa克隆質(zhì)粒;
　　 2.2構(gòu)建pEGFP-N1-COXⅦa表達(dá)質(zhì)粒:大量擴(kuò)增含pEGFP-N1空質(zhì)粒的大腸桿菌,抽提得到pEGFP

8、-N1空質(zhì)粒;將pGM-T-COXⅦa和pEGFP-N1分別用BglⅡ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切片段純化回收后用T4連接酶進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂板,挑克隆,搖菌抽提質(zhì)粒后酶切鑒定含COXⅦa基因的克隆,大量擴(kuò)增該克隆后抽提質(zhì)粒,得到pEGFP-N1-COXⅦa表達(dá)質(zhì)粒;
　　 2.3測(cè)序:將RT-PCR擴(kuò)增的COXⅦa片段和pEGFP-N1-COXⅦa重組質(zhì)粒送上海生工測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與genebank中

9、序列進(jìn)行比對(duì);
　　 2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞:用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pEGFP-N1-COXⅦa重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Leydig細(xì)胞,分為空白對(duì)照組、空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組和轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-COXⅦa組:
　　 2.5陽(yáng)性細(xì)胞鑒定:在熒光顯微鏡下觀察,有綠色熒光表達(dá)者為陽(yáng)性細(xì)胞,并用MitoTracker(R)Red CM-H2XRos孵育,共聚焦激光顯微鏡觀察pEGFP-N1-COXⅦa在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位;
　　 2.6細(xì)胞

10、功能檢測(cè):細(xì)胞蘭TM檢測(cè)細(xì)胞活力,化學(xué)發(fā)光法測(cè)定培養(yǎng)上清中總睪酮濃度,RT-PCR和western blotting分別檢測(cè)COXⅦa mRNA和蛋白表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行蛋白定位。
　　 3 RNA干擾
　　 3.1轉(zhuǎn)染:將篩選出的抑制效應(yīng)最強(qiáng)的SiRNA轉(zhuǎn)染PADAM模型大鼠的Leydig細(xì)胞,分為空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組、RNA干擾組、陽(yáng)性對(duì)照組和熒光標(biāo)記陰性對(duì)照組(觀察轉(zhuǎn)染效率);
　　 3.2轉(zhuǎn)

11、染效率:熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記陰性對(duì)照組,判斷轉(zhuǎn)染效率;
　　 3.3細(xì)胞功能檢測(cè):細(xì)胞蘭TM檢測(cè)細(xì)胞活力,化學(xué)發(fā)光法測(cè)定培養(yǎng)上清中總睪酮濃度,RT-PCR和western blotting分別檢測(cè)COXⅦa mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 COXⅦa具有降低細(xì)胞活力、抑制睪酮分泌的作用。
　　 第三部分 COXⅦa對(duì)類固醇合成酶的影響及RNA干擾的體內(nèi)研究
　　 目的:探討COXⅦa

12、對(duì)大鼠睪酮合成的影響及其與類固醇合成酶和急性調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)系,利用RNA干擾和中藥何首烏飲探索PADAM治療的新方法。
　　 方法:
　　 1 COXⅦa過表達(dá)對(duì)青年大鼠睪酮合成及類固醇合成酶和蛋白的影響
　　 1.1動(dòng)物分組:3月齡清潔級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分為pEGFP-N1-COXⅦa轉(zhuǎn)染組(模型組)、空質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組、葡萄糖對(duì)照組(葡萄糖組)和空白對(duì)照組,每組各8只動(dòng)物;
　　 1.2化學(xué)發(fā)光法測(cè)定各

13、組大鼠血清總睪酮濃度,生物化學(xué)方法檢測(cè)血清SOD、T-AOC活力及MDA含量,RT-PCR和western blotting分別檢測(cè)COXⅦa.3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StAR mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 2 RNA干擾及何首烏飲對(duì)PADAM大鼠睪酮合成及類固醇合成酶和蛋白的影響
　　 2.1建立PADAM大鼠模型:清潔級(jí)8周齡雄性SD大鼠,D-半乳糖300mg/kg/d腹腔注射,連續(xù)用藥50d;<

14、br>　　 2.2動(dòng)物分組:正常對(duì)照組、PADAM模型組、RNA干擾組、睪酮注射組(陽(yáng)性對(duì)照組)、何首烏飲治療組和模型對(duì)照組,每組各8只動(dòng)物。
　　 2.3化學(xué)發(fā)光法測(cè)定各組大鼠血清總睪酮濃度,生物化學(xué)方法檢測(cè)血清SOD、T-AOC活力及MDA含量,RT-PCR和western blotting分別檢測(cè)COXⅦa、3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StAR mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　

15、1 COXⅦa過表達(dá)可致青年大鼠睪酮濃度下降,類固醇合成酶和急性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)減少;
　　 2 PADAM模型大鼠經(jīng)RNA干擾及何首烏飲治療后,大鼠睪酮合成能力均得到部分恢復(fù),類固醇合成酶和急性調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)增加;
　　 3 COXⅦa在大鼠衰老過程中發(fā)揮作用,可能與類固醇合成酶和急性調(diào)節(jié)蛋白有關(guān);
　　 4靶向COXⅦa的RNA干擾治療和何首烏飲治療可以延緩衰老。
　　 第四部分 COXⅦa影響Leydig

16、細(xì)胞睪酮合成的機(jī)理研究
　　 目的:探討MAPK信號(hào)通路是否參與COXⅦa對(duì)Leydig細(xì)胞睪酮合成的調(diào)節(jié)過程。
　　 方法:
　　 分別對(duì)青年大鼠和PADAM模型大鼠的Leydig細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-COXⅦa重組質(zhì)粒和RNA Oligo后,進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn):
　　 1流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:
　　 2 RT-PCR檢測(cè)3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StAR mRNA;

17、>　　 3免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)3β-HSD、17β-HSD、P450scc、StAR、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá);
　　 4 western blotting檢測(cè)3β-HSD、17β-HSD、P450scc、StAR以及Bax、Bcl-2、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、P38、p-P38蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1在COXⅦa過表達(dá)的Leydig細(xì)胞,p-ERK1/2和p-JNK高表

18、達(dá),睪酮分泌減少,Bcl-2/Bax下降,細(xì)胞凋亡增加,3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StAR蛋白表達(dá)減少,提示P-ERK1/2和P-JNK抑制類固醇合成酶活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;
　　 2在COXⅦa干擾的Leydig細(xì)胞,p-ERK1/2和p-JNK低表達(dá),睪酮分泌增加,Bcl-2/Bax升高,細(xì)胞凋亡減少,3β-HSD、17β-HSD、P450scc和StAR蛋白表達(dá)增加,提示抑制ERK1/2和JNK蛋白活化可