利尿鈉肽信號通路在糖尿病小鼠胃輕癱中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病胃輕癱(diabeticgastroparesis，DGP)是常見于糖尿病患者的胃腸道慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著糖尿病病人的消化與吸收功能。引起糖尿病胃輕癱的原因有很多，近年來的大量研究證實(shí)糖尿病引起的胃平滑肌起搏細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞(intestinalcellsofCajal，ICC)數(shù)量減少、網(wǎng)絡(luò)破壞以及腸神經(jīng)病變是導(dǎo)致糖尿病胃輕癱的兩個重要原因，但其損傷的確切機(jī)制尚不清楚。利尿鈉肽(natriureticpeptides，N

2、Ps)家族是由一類結(jié)構(gòu)相似的多肽所組成，最早在心臟被發(fā)現(xiàn)，后來在體內(nèi)的其他很多部位也檢測到它們的存在。NPs通過與細(xì)胞膜上的三種利尿鈉肽受體相結(jié)合來發(fā)揮作用，對人體的生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究結(jié)果表明，利尿鈉肽受體(natriureticpeptidereceptor，NPR)在胃平滑肌和ICC上均有分布，并且NPs抑制胃平滑肌收縮、抑制ICC起搏電流，這表明NPs在胃運(yùn)動調(diào)控中起著抑制性調(diào)節(jié)作用。但是，NPs信號通

3、路是否參與糖尿病引起的Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，是否直接參與糖尿病引起的胃動力障礙以及是否參與糖尿病引起的腸神經(jīng)病變目前尚未見報(bào)道。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、電生理學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在鏈脲佐菌素(Streptozotocin，Streptozoein，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型上，探討了NPs信號通路在糖尿病胃輕癱中的作用及其機(jī)制。
　　研究結(jié)果如下:
　　一、NPs信號通路對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胃I

4、CC損傷的影響
　　1.通過對實(shí)驗(yàn)組與對照組雄性ICR小鼠的腹腔分別注射STZ溶液(200mgSTZ每千克小鼠)、安慰劑，60天后測其血糖，從實(shí)驗(yàn)組挑選出血糖濃度大于16mmol/L的小鼠作為糖尿病模型組。結(jié)果表明，糖尿病組小鼠的平均血糖濃度為25.6±1.2mmol/L(n=84)，明顯高于對照組小鼠(6.1±0.7mmol/L，n=100);糖尿病組小鼠的平均體重降低也非明顯，僅為19.3±1.6mg，而對照組為33.7±0.

5、9mg。
　　2.通過免疫熒光染色法和免疫印跡法觀察了糖尿病小鼠胃平滑肌組織ICC標(biāo)記物絡(luò)氨酸受體激酶(c-Kit)以及膜結(jié)合干細(xì)胞因子(mSCF)的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病小鼠胃組織的熒光強(qiáng)度均明顯低于正常小鼠;免疫印跡方法(westernblot)檢測結(jié)果表明，c-Kit和mSCF在糖尿病小鼠胃組織的表達(dá)明顯低于正常小鼠。
　　3.利用實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)以及westernblot方法檢測了糖尿病小鼠胃平

6、滑肌組織NPs受體的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病小鼠胃平滑肌組織內(nèi)的三種利尿鈉肽受體(NPR-A，B，C)，無論是mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平均明顯高于正常小鼠;胃平滑肌張力檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，CNP(C-typenatriureticpeptide)對小鼠胃竇平滑肌的收縮具有抑制性調(diào)節(jié)作用，且糖尿病小鼠胃平滑肌對CNP的反應(yīng)更加靈敏。
　　4.在體外培養(yǎng)的正常小鼠胃平滑肌細(xì)胞(gastricsmoothmusclecells，G

7、SMCs)上觀察了CNP對平滑肌細(xì)胞mSCF表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CNP劑量依賴地抑制平滑肌細(xì)胞mSCF表達(dá);NPR-C特異性激動劑cANF卻對GSMCs表達(dá)mSCF沒有顯著性影響;然而膜通透性8-Br-cGMP能模擬出CNP對平滑肌細(xì)胞mSCF表達(dá)的抑制作用。
　　5.通過MTT法間接觀察了NPR-C激動劑cANF對培養(yǎng)的正常小鼠GSMCs增殖與分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的cANF(10-6mol/L)可以明顯抑制GS

8、MCs的增殖與分化。
　　二、NPs信號通路對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠胃底NOS神經(jīng)元損傷的影響
　　1.利用免疫熒光染色觀察了小鼠胃底平滑肌組織HuC/D、nNOS和c-Kit的表達(dá)變化。結(jié)果表明，糖尿病小鼠胃底平滑肌組織NOS神經(jīng)元、ICC-IM的數(shù)量均明顯少于正常小鼠;進(jìn)一步利用westernblot檢測了糖尿病小鼠胃底平滑肌組織nNOS、c-Kit的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，糖尿病小鼠胃底nNOS、c-Kit的表達(dá)均明顯低于

9、正常小鼠。
　　2.通過生理學(xué)和電生理學(xué)方法觀察了糖尿病小鼠胃底平滑肌功能的改變。結(jié)果表明，電場刺激(Electricfieldstimulation，EFS)誘導(dǎo)的胃底平滑肌舒張反應(yīng)在糖尿病小鼠明顯減弱，而收縮反應(yīng)卻顯著加強(qiáng)。進(jìn)一步通過電場刺激的方法誘導(dǎo)胃底平滑肌細(xì)胞抑制性接點(diǎn)電位(inhibitoryjunctionpotentials，IJP)，通過細(xì)胞內(nèi)記錄的方法進(jìn)行記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病小鼠胃底IJP持續(xù)時(shí)間中L-N

10、AME敏感的(即NO組分相關(guān)的)時(shí)間明顯縮短。
　　3.通過westernblot檢測了胃底平滑肌組織NPs三種受體的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病小鼠胃底平滑肌組織內(nèi)三種利尿鈉肽受體(NPR-A，B，C)的表達(dá)水平明顯高于正常小鼠。
　　4.通過免疫組織化學(xué)方法在胃底平滑肌組織冰凍切片上觀察了胃底腸神經(jīng)中NPRs的分布情況。結(jié)果表明，胃底腸神經(jīng)系統(tǒng)有NPR-A，B的分布。
　　5.利用組織孵育的方法觀察了NPRs激動

11、劑CNP對胃底平滑肌組織nNOS表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CNP明顯劑量依賴地抑制體外孵育的胃底平滑肌組織(孵育24h)nNOS的表達(dá)。
　　6.利用neuro-2α細(xì)胞株，觀察NPRs、nNOS表達(dá)以及cGMP對nNOS表達(dá)的影響。首先，利用免疫組織化學(xué)方法觀察了neuro-2α細(xì)胞NPs受體以及NOS表達(dá)情況。結(jié)果顯示，neuro-2α細(xì)胞中存在大量的NOS陽性細(xì)胞，但NPRs染色顯示陰性。因此，我們進(jìn)一步觀察了NPs的中間信

12、號物質(zhì)cGMP對neuro-2α細(xì)胞NOS表達(dá)的影響。結(jié)果表明，細(xì)胞膜通透性8-Br-cGMP處理24h后，高濃度的8-Br-cGMP(10-6mol/L)可以明顯抑制nNOS的表達(dá)。
　　以上結(jié)果提示:①糖尿病引起的胃平滑肌組織NPs信號通路上調(diào)，通過NPs/NPR-A，B/cGMP途徑抑制胃平滑肌細(xì)胞mSCF表達(dá)，通過NPs/NPR-C通路抑制平滑肌增殖與分化，最終下調(diào)mSCF/c-Kit號通路使ICC數(shù)量減少;②糖尿病引起的