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文檔簡介
1、西南大學碩士學位論文糞腸球菌ZD34菌株(EnterococcusfaecalisZD34)產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的生物學研究姓名:伍先紹申請學位級別:碩士專業(yè):食品科學指導教師:賀稚非20090601兩南人學碩十學何論文的生長穩(wěn)定期可達劍晟人的生物活性。3按優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件,按2%(v/v)的接種量接種菌齡為10h的EfaecalisZD34菌株種子發(fā)酵液于改良CM培養(yǎng)基中,34“C靜止培養(yǎng)28h后12000rpm離心5min制備發(fā)酵上清液,
2、用55%的硫酸銨飽和濃度沉淀拮抗物質(zhì),4“C放置過夜后12000rpm離心10min,用含20mmol/LNaCI的02mol/L醋酸鹽緩沖液(pH5O)洗滌沉淀,即收集到含拮抗物質(zhì)的粗提液。將含拮抗物質(zhì)的粗提液上CM52離子交換色譜柱(25crux20era),用含o~10m01]LNaCI的02mol/L醋酸鹽緩沖液(pH5O),每隔01mol/LNaCI梯度進行步進式洗脫,在含04mol/LNaCI的O2mol/L醋酸鹽緩沖液(p
3、H5O)的洗脫管中得到一個活性峰。將有最大活性的洗脫液合并,可用分子截留量為1000Da的透析袋濃縮或用80%的硫酸銨飽和濃度沉淀過夜后12000rpm離心15rain,用無菌去離子水洗滌沉淀濃縮回收拮抗物質(zhì)。濃縮回收的拈抗物質(zhì)上SephadexG25凝膠過濾色譜進一步純化,用無菌去離子水洗脫,得到一個活性峰。經(jīng)Tricine—SDSPAGE電茫:,析,試驗結果表明拈抗物質(zhì)的分f量在3000Da左右。4反相高效液相色譜層析(RPHPLC
4、)再進一步分離純化SephadexG25凝膠過濾色譜層析收集的活性峰。實驗在HypersilQDS2柱(C18)(46mmx250mill,伊力特,中國)上進行;應用流動相:A相為95%乙腈01%三氟乙酸,B相為5%乙腈01%三氟乙酸:40min內(nèi)A相跑梯度從40%至100%;流速為lml/mim檢測波長為280nm。RPHPLC試驗結果表明拮抗物質(zhì)基本上得到了純化。拮抗物質(zhì)的出峰保留時間為10405min。收集峰尖部分,經(jīng)電噴霧質(zhì)譜法
5、(ESIMS/MS)檢測分析,確定拈抗物質(zhì)的分子量約為3434Da。5拮抗物質(zhì)的理化性質(zhì)試驗研究結果表明,拮抗物質(zhì)耐pHl~13:100“C處理10min活性基本不變,100“C處理60min仍有活性,但是有很人降低,表明該拮抗物質(zhì)有很好的穩(wěn)定性。拮抗物質(zhì)經(jīng)蛋白酶E(37℃,pH70)、蛋白酶K(37℃,pH70)和胰蛋白酶(30℃,pH7O)處理6h后均失活,進一步確定該拮抗物質(zhì)為細菌素。關鍵詞:EfaecalisZD34拮抗物質(zhì)分子
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