煙草磷酸吡哆醛水解酶的分離純化與表征.pdf

1、維生素B6(VB6)是一種水溶性維生素，游離型為吡哆醇(Pyridoxine，PN)、吡哆胺(Pyridoxamine，PM)和吡哆醛(Pyridoxal，PL)，相應(yīng)磷酸酯形式為磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate，PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate，PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate，PLP)。其中PLP是VB6的主要輔酶形式，參加催化涉及氨

2、基酸的代謝反應(yīng)，在合成和代謝的反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。在不同VB6化合物間的相互轉(zhuǎn)變的途徑中，磷酸酶發(fā)揮重要的作用，可以使磷酸酯形式的VB6去磷酸化生成游離形式的VB6。
　　 煙草是一種經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著重要的作用。同時(shí)，煙草作為一種模式植物，廣泛用于植物生理生化的研究。磷酸吡哆醛水解酶(PLP水解酶)在煙草體內(nèi)VB6的轉(zhuǎn)換代謝中起著重要作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨沉淀、DEAE-SepharoseFast

3、Flow陰離子交換、SephadexG-100凝膠過濾和SPSephadexC-25陽(yáng)離子交換柱層析等步驟，對(duì)煙草PLP水解酶進(jìn)行了分離純化。結(jié)果顯示：該酶被純化了119.6倍，比活力為1110.09U/mg，得率為28.49％，經(jīng)凝膠過濾和SDS-PAGE測(cè)得該酶的全分子量為49.6kDa，亞基分子量約為25kDa。
　　 對(duì)PLP水解酶的部分酶學(xué)性質(zhì)研究，得出該酶的最適溫度為50℃，最適反應(yīng)pH為5.5。但在50℃條件下該酶

4、很不穩(wěn)定，在短時(shí)間內(nèi)活性損失較大，而在30℃～40℃條件下，該酶能保持較好的活性穩(wěn)定。
　　 Mg2+、Ca2+、Mn2+等對(duì)該酶有激活作用，以Mg2+作用最強(qiáng)，其次是Ca2+、Mn2+、Zn2+和Cu2+。金屬離子螯合劑EDTA對(duì)酶具有抑制作用，加入Mg2+后抑制作用得到解除。產(chǎn)物(磷酸三鈉和PL)對(duì)酶活性具有很強(qiáng)的抑制性，底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑ATP和對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pNPP)也具有較強(qiáng)的抑制作用。
　　 在最適反應(yīng)條件