土曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的關(guān)鍵技術(shù)和新工藝探索.pdf

1、洛伐他汀(Lovastatin)是一種重要的降膽固醇藥物，目前主要采用土曲霉(Aspergillus terreus)液體深層發(fā)酵的方法生產(chǎn)。根據(jù)土曲霉的菌絲生長特性及洛伐他汀為胞內(nèi)產(chǎn)物的特點，本文提出了采用土曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀，并系統(tǒng)地研究了其中的關(guān)鍵問題。 在固態(tài)發(fā)酵中，準確測定生物量是一項非常重要但又尚未很好解決的問題。本文對三種細胞組分(核酸、麥角固醇、氨基葡萄糖)作為生物量測定指標的方法進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)土曲霉

2、菌體中的核酸、麥角固醇和氨基葡萄糖含量都分別與菌體量存在較好的正線性關(guān)系。但菌體中麥角固醇含量受培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基成分的影響較大；氨基葡萄糖量雖不受培養(yǎng)時間的影響，但與培養(yǎng)基成分的關(guān)系密切。因此上述二種細胞組分都不是測定生物量的最優(yōu)選擇。菌體中的核酸含量基本不受培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基的影響，且測定方法簡單，適合于土曲霉和紅曲霉固態(tài)發(fā)酵時生物量的精確測定。 考察了A．terreus ZJU-510菌株的生理和菌絲生長特性。土曲霉具有一定的

3、淀粉酶活和纖維素酶活，適合在富含淀粉和纖維素的固態(tài)基質(zhì)上生長，但在不同培養(yǎng)基上的生長形態(tài)差異較大：在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲的生長較弱，容易產(chǎn)生孢子；在查氏培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基上，菌絲生長較好而產(chǎn)孢子較少；在大米基質(zhì)上，土曲霉較容易產(chǎn)孢子，菌絲生長較差，而且底物的利用不完全。由于洛伐他汀是菌絲體內(nèi)的產(chǎn)物，固態(tài)發(fā)酵中控制孢子生成是需要注意的重要問題。 在三角瓶中系統(tǒng)地優(yōu)化了土曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的條件，通過單因素實驗，得到了土曲

4、霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀的較優(yōu)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，采用二段固體發(fā)酵工藝(先32℃培養(yǎng)3天，然后28℃培養(yǎng)8天)，洛伐他汀的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量達到了3.36mg/g干曲?？疾炝斯虘B(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)物、基質(zhì)含水量和pH值等主要發(fā)酵參數(shù)的變化規(guī)律，研究了lovastatin合成的動力學，發(fā)現(xiàn)在固態(tài)發(fā)酵的1-5天內(nèi)，菌絲量和洛伐他汀的含量快速增加，以后則增加緩漫，至11天達到最高值。說明洛伐他汀雖然屬于次級代謝產(chǎn)物，但與菌絲生長仍有一定的相關(guān)性。進一步利用

5、響應(yīng)面優(yōu)化法對固態(tài)發(fā)酵生成洛伐他汀的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，所獲得的最佳發(fā)酵條件為：在大米培養(yǎng)基中添加乙酸鈉0.54％、葡萄糖3.36％、蛋白胨1.5％，基質(zhì)初始含水量為45％，接種量為25％。在此條件下洛伐他汀產(chǎn)量為3.99 mg/g干曲，比未優(yōu)化前的產(chǎn)量3.36 mg/g提高了18.8％。 在小型自制固態(tài)發(fā)酵罐中，考察了基質(zhì)裝量、翻料操作以及通氣情況對發(fā)酵的影響，并測定了發(fā)酵過程中曲料溫度變化曲線。比較了三角瓶培養(yǎng)、

6、淺盤培養(yǎng)和小型發(fā)酵罐培養(yǎng)的結(jié)果進行了比較，結(jié)果表明，盡管淺盤培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)的產(chǎn)量都略低于三角瓶培養(yǎng)，但由于小型發(fā)酵罐的通氣性優(yōu)于淺盤培養(yǎng)，洛伐他汀的產(chǎn)量也較高。建立了能夠較好反應(yīng)土曲霉菌體生長、底物消耗和洛伐他汀合成的動力學模型，從而為進一步的固體發(fā)酵放大研究奠定了良好的基礎(chǔ)。在上述研究工作中，發(fā)現(xiàn)土曲霉固態(tài)發(fā)酵的洛伐他汀產(chǎn)量高于紅曲霉，但由于淀粉酶活力較弱，影響了其對固態(tài)底物的利用，使菌絲生長較差，容易產(chǎn)生孢子。紅曲霉菌株本身具有合

7、成洛伐他汀的能力，而且產(chǎn)淀粉酶活力也較高。研究表明，A.terreusZJU-510和M.rubber M7雙菌株混合固態(tài)發(fā)酵能夠達到優(yōu)勢互補，M.rubber M7菌株的高淀粉酶活可以有效地彌補A.terreus ZJU-510的不足，促進A.terreus ZJU-510菌株在固態(tài)基質(zhì)中生長，從而提高固態(tài)基質(zhì)中的菌體生物量和洛伐他汀的產(chǎn)量。 利用基因組重排技術(shù)對土曲霉洛伐他汀的高產(chǎn)菌株進行了選育。利用洛伐他汀濃度梯度平板和淀