食品溯源用基于DNA檢測的內(nèi)標(biāo)物示蹤法研究.pdf

1、食品安全問題一直是社會熱點問題,它直接關(guān)系著老百姓的生命健康。而針對現(xiàn)今食品制假摻假現(xiàn)象嚴(yán)重,食品溯源系統(tǒng)的建立不夠完善以及其在應(yīng)用過程中具有明顯的缺陷等問題,一些研究者提出了內(nèi)標(biāo)物示蹤法這一新的概念,其主要思想就是將特殊物質(zhì)作為“內(nèi)標(biāo)物”加入到商品內(nèi)用于該商品的跟蹤和防偽鑒別。核酸分子由于具有物化性質(zhì)穩(wěn)定且安全性、特異性強等優(yōu)點而成為“內(nèi)標(biāo)物”的首選,可以利用各種核酸擴增技術(shù)檢測核酸這一“隱形的生物條形碼”。為了彌補傳統(tǒng)防偽鑒別技術(shù)的

2、不足以及溯源系統(tǒng)應(yīng)用中的缺陷,本研究試圖建立多種基于核酸擴增技術(shù)的“內(nèi)標(biāo)物”示蹤法,也使該方法的實際應(yīng)用具有更加可靠的理論依據(jù),使該方法得以推廣。
　　本研究首先運用PCR技術(shù)和RCA(滾環(huán)擴增)技術(shù)分別對雙鏈和單鏈DNA在九種常見液態(tài)食品中的穩(wěn)定性進行了初步探究,結(jié)果顯示:單雙鏈DNA在大部分液態(tài)食品內(nèi)均能夠穩(wěn)定存在,這為實際的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。只有核酸分子在液態(tài)食品內(nèi)能夠穩(wěn)定存在,它才可以有作為“內(nèi)標(biāo)物”的資格。通過具體的檢

3、測實驗,也就此建立了基于PCR和RCA這兩種核酸檢測技術(shù)的內(nèi)標(biāo)物示蹤法,用于液態(tài)食品的溯源和防偽鑒別,其中PCR技術(shù)的檢測限能達(dá)到10 fmol/L甚至1 fmol/L,而RCA技術(shù)的檢測限為10 pmol/L。
　　相對于PCR和RCA擴增過程中都需要引物這一缺點,本文根據(jù)DNA重復(fù)序列的擴增特性研究以及DNA從頭合成的相關(guān)研究,開發(fā)了一種新的無引物核酸高效擴增方法,該方法主要基于以下原理:DNA鏈末端的回文序列可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)

4、,該發(fā)卡結(jié)構(gòu)的3’-末端能夠作為引物實現(xiàn)DNA鏈的延伸擴增。該技術(shù)可直接使用合成的長度為40~50nt的短鏈 DNA。結(jié)果顯示:該擴增方法在單純體系內(nèi)效果良好,且在以白酒為應(yīng)用對象的體系內(nèi)也獲得良好的效果,檢測限能達(dá)到100 pmol/L。為提高檢測限,在該擴增方法的基礎(chǔ)上做出了改進,即在擴增反應(yīng)體系內(nèi)加入相應(yīng)的內(nèi)切酶來提高反應(yīng)速率,其理論依據(jù)是DNA從頭合成過程中的 Cut-grow擴增模型。結(jié)果顯示,通過對實驗方法的改進,其檢測限能

5、達(dá)到1 fmol/L,但該擴增過程中可能會有其他非特異性反應(yīng)的發(fā)生,影響檢測結(jié)果,還需更多相關(guān)研究來解決這一問題。總之,這一新的擴增技術(shù)操作簡單,結(jié)果穩(wěn)定?？梢灶A(yù)測,在未來其在食品的源頭追溯及真?zhèn)舞b別方面一定會有非常廣泛的應(yīng)用前景。
　　通過測量以d(cGCAg)和d(cGAAAg)為基礎(chǔ)所構(gòu)成的特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Tm,判斷該結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性。將無引物核酸高效擴增技術(shù)與這一特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)相結(jié)合,設(shè)計了一種類似的無引物核酸擴增方法,該方