杜氏鹽藻過氧化物酶1互作蛋白的篩選與驗(yàn)證.pdf

1、背景
　　過氧化物酶(Peroxiredoxins，Prdxs)是一類在生物體內(nèi)廣泛存在并且具有較高表達(dá)量的抗氧化蛋白，可以催化還原生物體內(nèi)的H2O2、氫過氧化物以及過亞硝酸鹽，避免細(xì)胞受到損傷。過氧化物酶分子量在22～27kDa之間，目前已知在哺乳動(dòng)物中存在六種亞型(Prdx1～Prdx6)，根據(jù)過氧化物酶活性位點(diǎn)上半胱氨酸殘基的位置和數(shù)目不同，可以將其分為三類:1、典型2-CysPrdxs;2、非典型2-CysPrdxs;3、

2、1-CysPrdxs。Prdx1屬于典型的2-CysPrdxs，是Prdxs家族中分布最為廣泛的成員。該蛋白除了具有抗氧化的作用外，還具有多種其他功能，參與多種生理過程包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等。此外，近年來有研究表明Prdx1在多種腫瘤中異常高表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的信號(hào)調(diào)節(jié)。因此，Prdx1作為多種信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)分子，在細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮的作用日益受到關(guān)注，成為研究的熱點(diǎn)。
　　目的
　　探究杜

3、氏鹽藻Prdx1(DunaliellasalinaPeroxiredoxins1，DsPrdx1)在細(xì)胞內(nèi)的分子作用機(jī)制，篩選杜氏鹽藻中能夠與Prdx1相互作用的蛋白，并通過回交實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)兩者的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。
　　方法
　　1、利用酵母雙雜交的方法篩選杜氏鹽藻Prdx1的互作蛋白
　　設(shè)計(jì)上下游引物，利用PCR擴(kuò)增杜氏鹽藻Prdx1的開放閱讀框，酶切鑒定和測(cè)序鑒定正確后，將擴(kuò)增的杜氏鹽藻Prdx1的開放閱讀框

4、與酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體pGBKT7進(jìn)行連接，構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1。用PEG/LiAc法將所構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1分別轉(zhuǎn)入酵母菌Y187與AH109中，進(jìn)行誘餌質(zhì)粒的自激活和毒性檢測(cè)，鑒定誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1是否適用于酵母雙雜交系統(tǒng)。
　　以pGBKT7-Prdx1為誘餌，從杜氏鹽藻cDNA表達(dá)文庫中篩選與杜氏鹽藻Prdx1相互作用的蛋白。經(jīng)過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和α-半乳糖苷酶的

5、多次篩選，獲得陽性克隆。
　　2、相互作用的驗(yàn)證
　　回交實(shí)驗(yàn):提取酵母雙雜交陽性克隆的獵物質(zhì)粒，利用PEG/LiAC的方法與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞AH109中，通過營養(yǎng)缺陷型和α-半乳糖苷酶的篩選作用，進(jìn)行驗(yàn)證。
　　體外實(shí)驗(yàn):提取杜氏鹽藻總RNA，將提取的杜氏鹽藻總RNA與已純化的杜氏鹽藻Prdx1蛋白混合，冰上孵育15min進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)以及Prdx1保護(hù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)兩者的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果

6、>　　1、利用酵母雙雜交的方法篩選杜氏鹽藻Prdx1的互作蛋白
　　獲得正確的杜氏鹽藻Prdx1開放閱讀框并成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1。隨后將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y187和AH109中，經(jīng)過酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒自激活檢測(cè)和毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，所構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1對(duì)兩株酵母菌AH109和Y187沒有自激活作用，也沒有毒性，可以用于酵母雙雜交系統(tǒng)。
　　利用酵母雙雜交

7、的方法，以pGBKT7-Prdx1為誘餌質(zhì)粒從杜氏鹽藻cDNA文庫中篩選相互作用蛋白，經(jīng)過篩選得到168個(gè)陽性克隆，其中包括杜氏鹽藻28sRNA。Prdx1作為一種過氧化物酶，它的功能除了清除生物體內(nèi)過量的過氧化物，保護(hù)細(xì)胞免受損傷外，還可以間接或者直接的作為信號(hào)分子，參與多種與氧化有關(guān)的生理過程，但是目前對(duì)于Prdx1是否在RNA的代謝過程中起作用的研究非常少。由于28sRNA不容易分離與純化，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了總RNA作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研

8、究對(duì)象。
　　2、相互作用的驗(yàn)證
　　回交實(shí)驗(yàn):提取酵母雙雜交獵物質(zhì)粒pGADT7-RNA并將其與酵母誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1共轉(zhuǎn)入酵母菌AH109中，轉(zhuǎn)化后的酵母菌在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，并在X-α-gal的篩選下呈藍(lán)色，說明杜氏鹽藻Prdx1與RNA在酵母菌株中存在相互作用。
　　體外實(shí)驗(yàn):構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28(a)+-Prdx1，表達(dá)杜氏鹽藻Prdx1蛋白并進(jìn)行純化。提取杜氏鹽藻總RNA，將杜

9、氏鹽藻總RNA與已純化的杜氏鹽藻Prdx1蛋白混合孵育，進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)與Prdx1保護(hù)實(shí)驗(yàn)。最后，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均證明杜氏鹽藻Prdx1與杜氏鹽藻RNA存在相互作用。
　　結(jié)論
　　以杜氏鹽藻Prdx1為誘餌蛋白篩選杜氏鹽藻cDNA酵母文庫，發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻Prdx1蛋白與RNA之間存在相互作用，經(jīng)過后續(xù)的回交實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了兩者之間的相互作用。除了兩者之間具有相互作用的關(guān)系，通過Prdx1保護(hù)試驗(yàn)證明Prdx1對(duì)RNA