多壁碳納米管和富勒烯碳60對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的差異性影響.pdf

1、當(dāng)一種材料的組成顆粒的三維尺寸中至少有一維介于0.1～100納米之間時(shí)，該材料即可稱為納米材料。納米材料不但具有迥異于宏觀材料的理化性能，還可表現(xiàn)出獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)；納米材料的理化特征是決定其生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵因素。多壁碳納米管（MWCNTs）和富勒烯碳60（C60）是碳的兩種同素異形體，同時(shí)也是具有獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)、理化和生物學(xué)性能的納米材料。MWCNTs和 C60與神經(jīng)組織的相互作用是目前的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，并且這兩種碳基納米材料已表現(xiàn)出在中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的巨大應(yīng)用潛力。但由于CNS的復(fù)雜性，在將MWCNTs和C60安全而有效地引入CNS 之前，尚需開展全面和細(xì)致的研究以確保其應(yīng)用的安全性和有效性。星形膠質(zhì)細(xì)胞是CNS 十分活躍的細(xì)胞成分，其在人腦中的數(shù)量十倍于神經(jīng)元，在神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和生理、病理功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但目前有關(guān)納米材料與CNS 相互作用的研究主要集中于神經(jīng)元而較少關(guān)注膠質(zhì)細(xì)胞。有鑒于此，本課題對(duì)原型MWCNTs和C60與大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和由人

3、星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的相互作用開展了研究。本課題包括以下三部分內(nèi)容。
　　 第一部分
　　 細(xì)胞活力檢測(cè)是任何細(xì)胞水平研究的常規(guī)和基礎(chǔ)性工作。噻唑藍(lán)（MTT）和刃天青（resazurin）還原法是目前廣為應(yīng)用的兩種細(xì)胞活力檢測(cè)法。但我們發(fā)現(xiàn)，MTT和resazurin 法并不能準(zhǔn)確反映MWCNTs對(duì)細(xì)胞活力影響。為能準(zhǔn)確檢測(cè)MWCNTs的細(xì)胞效應(yīng)，我們建立、驗(yàn)證了一系列基于流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）的方法，并行之

4、有效地用于研究MWCNTs對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的效應(yīng)。作為對(duì)照，C60的細(xì)胞效應(yīng)也經(jīng)相同的方法進(jìn)行了分析。JC-1、DiOC6(3)、R123、FDA和PI是反映細(xì)胞不同功能的熒光探針。
　　 我們首先對(duì)它們的染色指征進(jìn)行了表征。結(jié)果表明JC-1和DiOC6 (3) 染色是線粒體膜電位 (ΔΨm）的良好指標(biāo)。ΔΨm是細(xì)胞攝取R123的驅(qū)動(dòng)力，但細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pgp對(duì)細(xì)胞內(nèi)R123的含量有決定性的影響。而另一種細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP 則是

5、細(xì)胞FDA 染色的決定因素。隨后分別以上述探針在原位（in situ）和非原位（ex situ）條件下對(duì)經(jīng)MWCNTs和C60處理（24h）的細(xì)胞進(jìn)行染色，并FCM 進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在in situ條件下，MWCNTs 顯著降低JC-1和DiOC6(3)的細(xì)胞染色但卻增強(qiáng)R123和FDA的染色。而在ex situ 條件下，除FDA 外，MWCNTs對(duì)其他探針的染色無顯著影響。與MWCNTs 相比，C60對(duì)上述探針的細(xì)胞染色無顯著影響

6、，in situ和ex situ 染色結(jié)果也無顯著差異。顯微鏡觀察顯示MWCNTs和C60對(duì)細(xì)胞形態(tài)無明顯影響。上述結(jié)果表明：1.探針的染色方式對(duì)染色結(jié)果有著根本影響提示，2.在本實(shí)驗(yàn)的暴露濃度和時(shí)間的條件下，MWCNTs和C60不影響細(xì)胞的總體活力，3. 但涉及細(xì)胞膜的一些細(xì)胞功能可能發(fā)生改變, 4. 熒光探針結(jié)合FCM 可方便、有效地反映MWCNTs的細(xì)胞效應(yīng)。
　　 第二部分細(xì)胞膜是維持細(xì)胞形態(tài)和完成細(xì)胞生命功能的重要結(jié)構(gòu)

7、，同時(shí)也是細(xì)胞與納米材料相互作用的起始界面。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換是細(xì)胞膜的一個(gè)重要功能。細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如Pgp和MRP是完成跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要機(jī)制。我們?cè)谇懊娴墓ぷ髦杏^察到MWCNTs能提高細(xì)胞內(nèi)羅丹明123(R123)和熒光素(Flu)的含量。R123和Flu分別是Pgp和MRP的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)底物，因此推測(cè)MWCNTs 可能影響細(xì)胞膜，尤其是Pgp和MRP 介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在此部分工作中我們即對(duì)此假設(shè)進(jìn)行了檢驗(yàn)：以MWCNT

8、s 處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后，分析了細(xì)胞對(duì)Pgp和MRP 特異性底物的攝取、潴留和外排動(dòng)力學(xué)。Pgp的底物為R123和阿霉素（DOX）；MRP的底物為熒光素（Flu）
　　 和羧基熒光素（CF）；并仍以C60作為對(duì)照。結(jié)果表明，經(jīng)過MWCNTs 處理后，in situ細(xì)胞對(duì)DOX的攝取顯著降低，但對(duì)其他藥物的攝取無明顯改變；同時(shí)MWCNTs 可顯著增加 R123、Flu和CF在in situ細(xì)胞內(nèi)的潴留。動(dòng)力學(xué)分析表明MWCNTs 明

9、顯降低ex situ細(xì)胞對(duì)R123和Flu的外排速率。與MWCNTs 相比，C60對(duì)各底物的細(xì)胞攝取、潴留以及外排速率無明顯影響。上述結(jié)果提示MWCNTs 可影響跨細(xì)胞膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，特別是Pgp和MRP 介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 第三部分前面的工作利用大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞模型表明MWCNTs 可抑制細(xì)胞膜Pgp和MRP介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。Pgp和MRP在人體內(nèi)有廣泛的分布并有重要的生理和病理意義。尤其值得重視的是，腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)Pgp和M

10、RP是腫瘤多藥耐藥（MDR）現(xiàn)象的重要機(jī)制。因此在人腫瘤細(xì)胞中研究MWCNTs對(duì)Pgp和MRP的影響更具實(shí)際意義和價(jià)值。鑒于此，此部分工作在MDR人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中驗(yàn)證了MWCNTs對(duì)Pgp和MRP的效應(yīng)，并圍繞MRP對(duì)MWCNTs的效應(yīng)進(jìn)行了初步的機(jī)制研究。MRP的轉(zhuǎn)運(yùn)功能依賴于還原型谷胱甘肽（GSH）的參與。同時(shí)，細(xì)胞膜電位也是Flu 外排的重要調(diào)控因素。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，減少細(xì)胞內(nèi)的GSH和改變細(xì)胞膜電位均可影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)Flu的外排

11、轉(zhuǎn)運(yùn)。我們?cè)诮?jīng)MWCNTs 處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中檢測(cè)到大量活性氧（ROS），同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的GSH水平顯著降低。兩種細(xì)胞膜電位探針（DiBAC4(3)和DiOC6(3)）染色分析也顯示MWCNT 可降低細(xì)胞膜電位。上述結(jié)果提示MWCNTs對(duì)MRP的影響機(jī)制涉及細(xì)胞膜電位改變和氧化應(yīng)激所致的GSH 減少。
　　 總結(jié)1. 研究方法和手段的選擇、驗(yàn)證和優(yōu)化對(duì)于納米材料的生物學(xué)效應(yīng)研究尤為重要。本課題表明流式細(xì)胞技術(shù)是適用于MWCNTs細(xì)胞