中國主要出口蝦類的分子鑒定標記研究.pdf

1、蝦的種類繁多，僅聯(lián)合國糧農組織（FAO）列出的具有商業(yè)或具有潛在商業(yè)價值的蝦就有300多種，為重要的經濟水產品之一。據FAO統(tǒng)計，全球每年捕撈和養(yǎng)殖蝦的產量約為600萬噸，其中約60％進行國際貿易。目前蝦產品年出口值超過140億美元，占漁業(yè)總出口值的16％，在國際貿易中具有重要地位。當前，中國沿海養(yǎng)殖和捕撈（含海水和淡水）的蝦主要有斑節(jié)對蝦（Penaeus.momodon）、凡納對蝦（Penaeus vannamei）、中國對蝦（Pen

2、aeus.chinensis）、日本對蝦（Penaeus japonica）、羅氏沼蝦（Maeobrachium rosenbergii）、墨吉對蝦（Penaeus merguiensis）、中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）、鷹爪蝦（Trachypenaeus curvirostris）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）等，年出口量近30萬噸，產值近17億美元。
　　 近年來，國際

3、上對貿易品種的要求日益嚴格，物種鑒定已成為出口農產品、食品的技術性貿易壁壘之一。通常，蝦類的品種鑒定主要依據形態(tài)學標準（如外形、顏色等）來進行。然而當用于形態(tài)辨別的部分被去除、形態(tài)非常相近或未形成可辨別形態(tài)時，蝦類的品種鑒定則顯得非常困難，因此采用分子鑒定標記進行品種鑒定的研究日益引起重視，如核糖體轉錄間隔區(qū)、線粒體細胞色素氧化酶C基因、線粒體細胞色素b基因等。
　　 本研究首先利用蝦類核糖體基因高度保守的18s、28s和中間的

4、5.8s區(qū)域，設計出了通用引物，對中國幾種主要出口蝦類ITS1區(qū)域進行PCR擴增并測序。根據測序結果，篩選出了合適的選擇性內切酶，針對所研究各蝦品種的ITS1序列產生出特異性的酶切圖譜，將它們作為分子標簽，應用于中國主要出口蝦類品種及其產地的快速鑒定，具有特異性強、重復性高、檢測時間短、成本低的特點。在該部分研究中，利用所設計的引物，所得到蝦類ITS1長度變化在448 bp（戴氏赤蝦）到1491 bp（日本沼蝦）之間，GC含量為40.9

5、5-66.83％，其中戴氏赤蝦和日本沼蝦的ITS1序列為目前所報道的最短和最長的蝦類ITS1序列。各蝦品種的ITS1序列比較發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星序列大多出現(xiàn)在5’端和中間區(qū)域。同一種蝦品種的微衛(wèi)星序列差異與群體間ITS1的變異和長度多態(tài)性緊密相關，而且對蝦科對蝦屬各蝦品種比較發(fā)現(xiàn)，親緣關系越近，其微衛(wèi)星序列相似度越高。對蝦科5個蝦品種之間可用ITS1數(shù)據進行很好的區(qū)分。此外，結合PCR-RFLP技術，不同蝦品種的ITS1序列可產生特定的酶切片段

6、，可以此對它們進行有效區(qū)分。這些結果表明，ITS1序列作為一個重要的分子標簽，在不同分類水平上具有很高的變異性，在蝦類品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中具有重要的作用。
　　 本研究還采用熒光標記引物的AFLP分析方法，對中國主要出口蝦類資源進行了遺傳變異和品種鑒別研究，依據AFLP標記的數(shù)據結果，我們對對蝦科下不同屬的蝦類系統(tǒng)親緣關系進行了分析。結果顯示：在遺傳距離上，日本對蝦（P.japonicus）和寬溝對蝦（P.monodon）之

7、間最小，為0.214：中華管鞭蝦（S.crassicornis）和鷹爪蝦（T.curvirostris）之間最大，為0.659；遺傳一致度上，日本對蝦（P.japonicus）和寬溝對蝦（P.monodon）最近，為0.787；管鞭蝦科的中華管鞭蝦（S.crassicornis）和對蝦科鷹爪蝦屬的鷹爪蝦（T.curvirostris）之間最遠，為0.341。二種分析方法結果基本一致，說明基于AFLP標記揭示的不同蝦類之間的遺傳距離比較穩(wěn)

8、定。依據Jaccard遺傳相似性系數(shù)構建對蝦科下所有供試蝦樣品的UPGMA系統(tǒng)聚類關系圖，其中中華管鞭蝦（S.crassicornis）作為Outgroup單元對照，獨立在外，成一個單獨的分支，所有對蝦科蝦類均聚為一類，在Jaccard遺傳相似性系數(shù)為0.38處，對蝦科內不同屬蝦類可進一步細分為三大分支。第1分支主要由哈氏仿對蝦（P.hardwickii）、刀額新對蝦（M.ensis）和戴氏赤蝦（M.dalei）三類組成：第Ⅱ分支主要由

9、寬溝對蝦（P.latisulcatus）、同本對蝦（P.japonicus）和凡納濱對蝦（L.vannamei）組成；第Ⅲ分支僅由鷹爪蝦（T.curvirostris）組成。這表明利用.AFLP標記可以揭示不同蝦類之間的遺傳差異程度，分析物種之間的系統(tǒng)親緣關系。
　　 本研究中12對引物共擴增出了841條DNA譜帶，所有條帶的分子量范圍在50～550bp之間，其中601條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性位點百分率為71.5％，平均每對引物擴

10、增出70.1條總帶和50.1條多態(tài)性條帶。相比于其它研究者采用AFLP標記對對蝦科蝦類的分析結果來說，多態(tài)性位點百分率相對偏高。在引物鑒別效率方面，12對AFLP引物中可將所有供試蝦樣品100％區(qū)分開的引物組合有4對：E-ACG/M-CAA、E-AGG/M-CTA、E-AGG/M-CTC和E-AGG/M-CTT，12對引物的平均鑒別效率達92.8％，可見AFLP標記用于蝦種水平上的鑒別效率非常高，這也間接反映出不同蝦之間的遺傳背景差異較