基于功能化納米顆粒的線粒體識(shí)別及細(xì)胞熒光成像研究.pdf

1、近年來(lái)，熒光納米材料優(yōu)良的熒光性質(zhì)使其在細(xì)胞及亞細(xì)胞層面的生物標(biāo)記研究中得到了廣泛的關(guān)注，為生物分析及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供了新的技術(shù)手段和方法。本研究小組利用二氧化硅熒光納米顆粒開(kāi)展了一系列生物標(biāo)記研究工作，但二氧化硅納米顆粒在亞細(xì)胞標(biāo)記中的研究還未有報(bào)道，本論文在實(shí)驗(yàn)室已有工作基礎(chǔ)上，開(kāi)展了二氧化硅熒光納米顆粒用于線粒體標(biāo)記的相關(guān)研究，研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒粒徑較大會(huì)影響亞細(xì)胞運(yùn)輸?shù)倪M(jìn)行，因此選擇小粒徑熒光材料金納米簇作為研究對(duì)象，考察其

2、作為細(xì)胞熒光標(biāo)記物的可行性。本論文主要從以下三個(gè)方面開(kāi)展工作：
　　 1.信號(hào)肽功能化二氧化硅納米顆粒的離體線粒體靶向作用研究
　　 以N.(p.馬來(lái)酰亞胺基苯基)異氰酸酯(N-(p-Maleimidophenyl)isocyanate，PMPI)為交聯(lián)劑，將線粒體信號(hào)肽分子共價(jià)修飾到二氧化硅熒光納米顆粒表面)構(gòu)建線粒體信號(hào)肽功能化二氧化硅熒光納米顆粒。采用熒光分光光度計(jì)、Zeta電位儀以及透射電子顯微鏡對(duì)修飾前后的二氧

3、化硅納米顆粒進(jìn)行表征。在此基礎(chǔ)上以分離純化的細(xì)胞核作為對(duì)照，采用流式細(xì)胞術(shù)考察了信號(hào)肽功能化二氧化硅熒光納米顆粒與分離純化的線粒體間的相互作用。結(jié)果表明：信號(hào)肽成功修飾在二氧化硅納米顆粒表面，并且納米顆粒粒徑在信號(hào)肽分子修飾前后沒(méi)有發(fā)生明顯變化；同時(shí)，線粒體信號(hào)肽修飾到二氧化硅納米顆粒表面后依然保持良好的生物活性，能夠介導(dǎo)二氧化硅納米顆粒特異性識(shí)別及結(jié)合分離純化的線粒體，從而為線粒體監(jiān)測(cè)以及線粒體功能調(diào)控研究提供了新的思路。
　　

4、 2.信號(hào)肽功能化二氧化硅納米顆粒的活細(xì)胞線粒體靶向研究
　　 在上一章研究工作基礎(chǔ)上，以Hela細(xì)胞為研究對(duì)象，考察了線粒體信號(hào)肽功能化二氧化硅熒光納米顆粒在活細(xì)胞內(nèi)的線粒體靶向情況。將信號(hào)肽功能化二氧化硅熒光納米顆粒和Hela細(xì)胞共同培育，并利用LysoTracker Green和MitoTrackerDeep Red對(duì)細(xì)胞內(nèi)溶酶體及線粒體進(jìn)行染色，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)納米顆粒在Hela細(xì)胞內(nèi)的分布情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明

5、：功能化二氧化硅熒光納米顆粒能夠通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，但是未能實(shí)現(xiàn)線粒體靶向而是滯留于溶酶體。氯喹處理能夠破壞溶酶體膜的完整性，但在氯喹處理后二氧化硅熒光納米顆粒并未進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而是粘附于溶酶體膜上，仍滯留于溶酶體中。本章工作為納米顆粒用于亞細(xì)胞標(biāo)記提供了具有參考價(jià)值的信息，熒光納米顆粒在亞細(xì)胞標(biāo)記領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用有賴(lài)于發(fā)展分散性好、粒徑小、非特異吸附小的納米材料。
　　 3.牛血清白蛋白介導(dǎo)合成的金納米簇用于細(xì)胞熒光成像研究

6、
　　 在上一章研究工作中發(fā)現(xiàn)納米顆粒粒徑較大不利于亞細(xì)胞運(yùn)輸?shù)倪M(jìn)行，發(fā)展小粒徑熒光物質(zhì)對(duì)實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞標(biāo)記十分必要。近年來(lái)金納米簇因其熒光特性得到很大改善且具有粒徑小、無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)而成為納米材料領(lǐng)域科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)并在熒光標(biāo)記研究中得到了一定應(yīng)用。本章以牛血清白蛋白介導(dǎo)合成了金納米簇，并利用熒光分光光度計(jì)，納米粒度及zeta電位儀和非變性聚丙烯酰胺蛋白質(zhì)電泳進(jìn)行了表征；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察了金納米簇與Hela細(xì)胞間的相互作用，同

7、時(shí)將其與生物素相交聯(lián)考察其用作熒光標(biāo)記物的可行性。結(jié)果表明：牛血清白蛋白.介導(dǎo)合成的金納米簇?zé)晒庑盘?hào)較強(qiáng)且在不同pH值溶液中熒光穩(wěn)定性好；與細(xì)胞共同孵育時(shí)可以通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)，在優(yōu)化培育時(shí)間和金納米簇濃度的條件下可實(shí)現(xiàn)較好的活細(xì)胞熒光標(biāo)記效果，并且在經(jīng)過(guò)細(xì)胞固定化處理后仍可保持其標(biāo)記形態(tài)；此外生物素化的金納米簇可以識(shí)別及標(biāo)記鏈霉親和素包被的微珠。以上研究對(duì)于金納米簇作為一種新型熒光標(biāo)記物在活細(xì)胞熒光成像領(lǐng)域中的進(jìn)一步應(yīng)用具有一定