大鼠腦缺血模型側(cè)支循環(huán)研究及差異表達lncRNA分析.pdf

1、目前在側(cè)支循環(huán)的研究中，多集中在急性缺血方面，而對慢性缺血側(cè)支循環(huán)的研究卻較少。將兩者進行對比研究未見有報道。隨著近年來基因技術(shù)、分子生物學(xué)和基因測序技術(shù)的進步，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA在細胞的增殖、分化、代謝凋亡等方面有著重要的調(diào)控作用，人類疾病的發(fā)生、發(fā)展也和它有密切關(guān)系。特別在血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌的研究中發(fā)現(xiàn)lncRNA在許多方面對其有調(diào)控作用。側(cè)支循環(huán)建立形成的基因調(diào)控目前仍未完全清楚，并且大部分研究集中于mRNA。lncRNA

2、調(diào)控側(cè)支循環(huán)的研究卻鮮有報道。因此我們構(gòu)建了大鼠急性和慢性缺血模型，進一步觀察大鼠急性或者慢性缺血狀態(tài)下顱內(nèi)各個血管變化進一步尋找可能的影響因素。同時對大鼠腦缺血區(qū)的腦血管做了二代的RNA-seq高通量測序。我們試圖在大鼠腦急性缺血模型和慢性缺血模型中尋找在血管生成和側(cè)支循環(huán)形成的異同，為可能的基因調(diào)控靶點提供一些證據(jù)。
　　第一部分 大鼠急性、慢性缺血模型及側(cè)支循環(huán)的建立
　　試驗方法:建立大鼠MCAO模型和慢性缺血模型，

3、選成年雄性Wistar健康大鼠，隨機分成三組:A組（假手術(shù)組），B組(MCAO模型組)，C組（慢性缺血組）。所有大鼠造模后均行激光散斑成像觀察，分別于蘇醒后2小時、12小時、24小時、48小時、72小時和1周每個時間段行神經(jīng)功能評分，后4個階段每組處死3只大鼠取腦，行HE和CD105染色，觀察腦側(cè)支循環(huán)建立和血管生成。
　　結(jié)果:
　　TTC染色示:B組梗死面積百分比達到20.30±4.62％，C組梗死面積百分比為3.02±

4、1.26％。激光散斑血流圖示:在A組造模后，腦血流無明顯變化。B組在MCAO側(cè)腦灌注明顯減少，降幅達60％以上，在梗死后軟膜動脈既開放向缺血區(qū)供血。C組全腦灌注明顯減低達50％以上，早期大腦中、大腦前仍有血流，較前明顯減少。HE染色B組腦組織水腫，病變區(qū)血管充血擴張大量神經(jīng)細胞死亡，C組在部分可見有少量血管充血，大腦皮層及海馬區(qū)可見部分神經(jīng)細胞變性皺縮壞死，結(jié)構(gòu)稀疏。CD105染色示在B組梗死核心區(qū)和梗死灶周邊均有新生血管生成，梗死灶周

5、邊明顯，隨著梗死時間延長新生血管逐漸增多，7天時最多。C組也有新生血管生成，相對B組較少。
　　第二部分 缺血后大鼠腦血管差異表達RNA研究
　　試驗方法:建立大鼠MCAO模型和慢性缺血模型，選成年雄性Wistar健康大鼠，隨機分成三組:A組（假手術(shù)組），B組（MCA0模型組），C組（慢性缺血組）。模型建立后48小時處死大鼠，立刻取右側(cè)缺血區(qū)腦血管，提取RNA，行二代高通量RNA-seq測序。利用Ballgown對兩組轉(zhuǎn)錄本

6、進行比較，尋找差異基因，應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫進行GO分析、pathway分析，構(gòu)建信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)(signal-net)分析和lncRNA與mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)(lncRNA-mRNA-net)分析。qRT-PCR驗證RNA-seq測序結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1、急性缺血組與對照組lncRNA與mRNA的分析:較篩選出差異lncRNA71個差異基因，其中34個上調(diào)，37個下調(diào)。mRNA有1963個，其中上調(diào)的有1142個，下調(diào)82

7、1個。在mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)中，與血管生成相關(guān)的mRNA中，基因Tek、Kdr、Plcb4和Plcg1在整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)起到了非常重要作用。Tek、Kdr能夠通過激活Plcb4對Prkce、Prkcb、Prkca、Itpr1、Pla2g4a、Mapk13和Mapk11組成的網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)控。Kdr也能夠通過Plcg1對上述網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)控。Itgb2能夠通過調(diào)控Fgf2來影響Adcy5繼而影響上述調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。ENSRNOT00000036680、EN

8、SRNOT00000084727同時對Plcg1調(diào)控，前者為正向調(diào)控，后者為負向調(diào)控。Tek未發(fā)現(xiàn)有l(wèi)ncRNA調(diào)控，對Kdr調(diào)控的lncRNA有三個，其中ENSRNOT00000077132調(diào)節(jié)能力最強為負向調(diào)控，ENSRNOT00000092096為正向調(diào)控。ENSRNOT00000073655對Plcb4進行負向調(diào)控。ENSRNOT00000087051對Adcy5進行正向調(diào)控。
　　2、慢性缺血組與對照組lncRNA與mR

9、NA的分析:篩選出差異lncRNA276個差異基因，其中66個上調(diào)，160個下調(diào)。mRNA有3289個，其中上調(diào)的有1776個，下調(diào)1513個。在mRNA的相互作用網(wǎng)絡(luò)中，與血管生成有關(guān)的mRNA中，Mapk1、Prkca同Nras和Kras構(gòu)成了主要的相互作用網(wǎng)絡(luò)。Nras、Kras與Mapk1將作用更密切并能調(diào)控Mapk8、Mapk9。我們推測在慢性缺血的過程中血管的生成主要是通過對Mapks調(diào)控。通過lncRNA與mRNA共表達網(wǎng)

10、絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)ENSRNOT00000092872對Kras進行負向調(diào)控，ENSRNOT00000076004對Nras調(diào)控。對Mapk1調(diào)控的lncRNA中作用最強的是ENSRNOT00000090397和ENSRNOT00000076495，前者為負向調(diào)控。ENSRNOT00000092832對Prkca進行調(diào)控。
　　3、慢性缺血組與急性缺血組lncRNA與mRNA的分析
　　對比急性和慢性缺血組的RNA數(shù)據(jù)分析:在有血管

11、生成有關(guān)的mRNA中，在兩組中均有表達的有330個。差異表達在4倍以上的有21個。Kcnab2、Atp6v1g2、Stmn4、Stim1、Cyp1b1、Fgf2等差異基因兩組之間是反向調(diào)節(jié)，而Kng2在兩組之間均為上調(diào)但B組差異倍數(shù)更顯著。B組與C組之間GO分析和pathway分析對比發(fā)現(xiàn)，Kcnab2、Stmn4僅在C組中有顯著性差異。Stim1、Cyp1b1僅在C組中有顯著性差異。Atp6v1g2在離子跨膜運輸功能上B組為下調(diào)，C組

12、上調(diào)，代謝通路上B組為下調(diào)，C組上調(diào)。從上數(shù)據(jù)我們可以看出，Kng2、Fgf2和Atp6v1g2在B、C兩組中具有相同的功能，相同的調(diào)控通路。ENSRNOT00000087079在調(diào)控Stmn4的lncRNA中調(diào)控能力最強。ENSRNOT00000002990對Serpine1負向調(diào)控，但在C組中ENSRNOT00000076446的調(diào)控能力較ENSRNOT00000002990強，正向調(diào)控。對Kng2的調(diào)控兩組沒有相同的lncRNA。

13、在兩組中ENSRNOT00000079300對lgf1調(diào)控均為負向調(diào)控。ENSRNOT00000092605對Ap6v1g2在兩組中均為正向調(diào)控，但在C組中ENSRNOT00000089288的調(diào)控能力較ENSRNOT00000092605強，負向調(diào)控。
　　結(jié)論:
　　1、急性梗死超早期的側(cè)支循環(huán)建立以固有動脈為主，如Willis動脈環(huán)，軟膜動脈。梗死后血管新生發(fā)生在24h內(nèi)出現(xiàn)，隨著梗死時間延長，血管新生越明顯，7天時仍

14、有明顯血管新生。血管新生在梗死灶核心和周邊均有，周邊明顯增多。慢性血管狹窄顱內(nèi)側(cè)支循環(huán)的建立主要以固有動脈為主，也存在部分血管新生但較急性腦梗死少。
　　2、急性缺血模型中Tek、Kdr、Plcb4、Plcg1對血管生成有重要調(diào)控作用，可能是通過VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路等通路調(diào)控進行調(diào)控，其中Mapks信號通路作用可能更明顯。ENSRNOT00000077132、ENSRNOT00000092

15、096和ENSRNOT00000073655對上述mRNA起到了調(diào)節(jié)作用。
　　3、慢性缺血模型中Mapk1、Prkca、Nras和Kras等基因在其中起到了重要作用調(diào)控作用，其PI3K-Akt信號通路和Mapk信號通路在其中貢獻較大。ENSRNOT00000092872、ENSRNOT00000076004和ENSRNOT00000092832等lncRNA對上述mRNA的調(diào)控作用強。
　　4、Kng2、Fgf2和Atp6