Porf-2調(diào)控神經(jīng)干細胞增殖、分化的分子機制及對視神經(jīng)損傷后視覺誘發(fā)電位的影響.pdf

1、研究背景:
　　視前區(qū)前調(diào)控因子2（Preoptic regulatory factor-2，Porf-2）是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一類生長調(diào)控因子。Porf-2蛋白自1990年在大鼠下丘腦視前區(qū)中被發(fā)現(xiàn)以來，其功能一直被忽視，僅有少量研究報道其在生殖-內(nèi)分泌系統(tǒng)中存在表達，與生長發(fā)育密切相關(guān)，而其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能罕有報道。近年來，Porf-2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能開始引起神經(jīng)科學界的重視。2011年，被報道Porf-2可以

2、影響神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）的增殖與凋亡。然而，該研究使用的是Porf-2的短肽段（75個氨基酸），無法準確反映Porf-2的功能，且缺乏深入的機制研究。此外，Porf-2的全長對原代NSCs的增殖及分化的影響目前國內(nèi)外尚未見報道。
　　研究目的:
　　1.探討Porf-2影響NSCs增殖、分化的分子機制。
　　2.探討視神經(jīng)損傷環(huán)境下Porf-2對NSCs增殖、分化及視覺誘發(fā)電位的影

3、響。
　　研究方法:
　　1．NSCs培養(yǎng)與鑒定選取孕14天的胚胎大鼠海馬組織，分離出NSCs，行傳代培養(yǎng)，Nestin、Porf-2鑒定及形態(tài)觀察。NSCs無血清分化培養(yǎng)+貼壁培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)分化，免疫熒光細胞化學法檢測神經(jīng)元標志物β-tubulinIII和神經(jīng)膠質(zhì)細胞標志物GFAP的表達情況。
　　2．病毒構(gòu)建采用基因工程技術(shù)將大鼠Porf-2基因插入慢病毒過表達載體pLenti-Ubc-EGFP-3FLAG，插入P

4、orf-2基因干擾序列構(gòu)建Porf-2基因沉默載體pHBLV-Porf-2siRNA-U6-Zsgreen，包裝重組質(zhì)粒。XhoI和BamHI雙酶切測序分析鑒定插入片段的正確性。通過重組慢病毒載體包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞包裝病毒，并測定病毒滴度。
　　3．慢病毒轉(zhuǎn)染及相關(guān)因子分析使用分別構(gòu)建的沉默、過表達慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs；采用免疫熒光法對轉(zhuǎn)染后的NSCs進行Nestin鑒定以及分化方向鑒定；采用免疫共沉淀技術(shù)檢測Porf-2與

5、Rac1的結(jié)合。使用GST-pull down技術(shù)分析Porf-2沉默、過表達狀態(tài)下對Rac1活性的影響。采用real-time PCR和Western Blot檢測Porf-2、Wnt3a、β-catenin、Wif-1、Dkk-1、Wnt-1、Wnt-3、Dishevelled、Frizzled-1、Frizzled-5、 LRP-5、LRP-6、Axin、APC及GSK-3βmRNA和蛋白的表達水平。
　　4．Porf-2對

6、NSCs增殖、分化的影響分別在轉(zhuǎn)染后第1、2、3、4、5、6、7、10、14d使用CCK8法檢測NSCs增殖；轉(zhuǎn)染后7天，使用Wnt3a蛋白孵育轉(zhuǎn)染細胞，觀察細胞增殖情況。使用EdU實驗檢測轉(zhuǎn)染后NSCs中 EdU+細胞比例；分別使用Rac1抑制劑、激動劑，Wnt抑制劑、激動劑通過CCK8、EdU法評估細胞增殖情況。免疫熒光染色檢測向β-tubulinIII及GFAP標記細胞的分化。
　　5．大鼠標準化視神經(jīng)損傷模型建立與視網(wǎng)膜下

7、腔定點注射：使用我們已建立的大鼠標準化視神經(jīng)損傷模型，使用夾閉力為90g的Yasargil動脈瘤夾鉗夾視神經(jīng)9s致傷。
　　6．Wnt3a蛋白的檢測:分別在視網(wǎng)膜下腔注射后7d、14d取出眼球并完整分離出視網(wǎng)膜組織。使用Western Blot法檢測損傷組及正常組大鼠視網(wǎng)膜組織中的Wnt3a蛋白的表達量。
　　7．移植細胞增殖能力檢測:用微量注射器分別向大鼠視神經(jīng)損傷側(cè)視網(wǎng)膜下腔注射2μl Porf-2-overexpres

8、sion-NSCs（1×105個/μl）懸液、Porf-2-knockdown-NSCs懸液（1×105個/μl）和GFP-NSCs懸液（1×105個/μl）。視網(wǎng)膜下腔注射后2周處死動物，行視網(wǎng)膜冰凍切片。采用免疫組化方法檢測移植細胞在宿主視網(wǎng)膜增殖情況，比較 BrdU指數(shù)。在視網(wǎng)膜下腔注射后第8周，采用視覺誘發(fā)電位技術(shù)檢測視覺功能，然后處死動物，行視網(wǎng)膜冰凍切片，采用免疫組化方法檢測移植細胞向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化的比例。

9、　　研究結(jié)果：
　　1.成功從胎鼠海馬組織分離、培養(yǎng)NSCs，誘導(dǎo)分化為β-tubulinIII陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性細胞的星形膠質(zhì)細胞。
　　2.成功構(gòu)建Porf-2沉默或過表達慢病毒載體（pLenti-Porf-2-Ubc-EGFP-3FLAG、pHBLV-Porf-2siRNA-U6-Zsgreen）經(jīng)限制性內(nèi)切酶檢測、基因測序及綠色熒光檢測證實攜帶Porf-2基因的重組慢病毒構(gòu)建成功，滴度大于2×108 TU/m

10、l。
　　3.轉(zhuǎn)染后NSCs在熒光顯微鏡下呈綠色，Nestin表達陽性；誘導(dǎo)分化后可見β-tubulinIII陽性和GFAP陽性細胞；免疫共沉淀結(jié)果顯示Porf-2與Rac1存在結(jié)合，且Porf-2基因沉默可以提高Rac1的活性，Porf-2過表達可以降低Rac1的活性。Wif-1、Dkk-1、Wnt-1、Wnt-3、Dishevelled、Frizzled-1、Frizzled-5、LRP-5、LRP-6、β-catenin、A

11、xin、APC和GSK-3β在沉默、過表達組均未見明顯變化（p>0.05）。Porf-2基因沉默組LEF-1、TCF和cyclin D1表達升高，p21表達降低；過表達組結(jié)果則相反，兩組間存在差異（p<0.05）。
　　4. CCK8檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后4d，5d，6d，7d、10d、14d，Porf-2基因沉默組的吸光度值明顯高于對照組及過表達組（p<0.05）。沉默組的EdU陽性細胞比例也明顯高于對照組及過表達組（p<0.05）

12、。在Porf-2沉默組，使用Rac1抑制劑、Wnt抑制劑可以逆轉(zhuǎn)Porf-2基因沉默的促增殖效果。而在Porf-2過表達組，使用Rac1激動劑、Wnt激動劑可以逆轉(zhuǎn)Porf-2過表達的抑制增殖效應(yīng)。血清誘導(dǎo)分化 NSCs行免疫熒光檢測，Porf-2-overexpression-NSCs、Porf-2-knockdown-NSCs組和GFP-NSCs組之間向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞的分化比例，組間比較無差異（p>0.05）。
　　5.

13、大鼠視神經(jīng)損傷后，其視網(wǎng)膜組織中Porf-2蛋白的表達較正常對照組明顯升高（P<0.05）。
　　6. Porf-2-knockdown-NSCs組的EdU指數(shù)高于Porf-2-overexpression-NSCs和GFP-NSCs組（P<0.05）。
　　7.移植后第8周，移植細胞行免疫熒光檢測，Porf-2-overexpression-NSCs、Porf-2-knockdown-NSCs組和GFP-NSCs組之間向神

14、經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞的分化比例，組間比較無差異（p>0.05）。
　　8. Porf-2-knockdown-NSCs組 P1波幅高于GFP-NSCs組及 Porf-2-overexpression-NSCs組，而Porf-2-overexpression-NSCs組P1波幅較低，兩組間存在差異（p<0.05）。Porf-2-knockdown-NSCs組P1峰潛時短于GFP-NSCs組及Porf-2-overexpression-

15、NSCs組，而Porf-2-overexpression-NSCs組P1波幅較長，兩組間存在統(tǒng)計學顯著性差異（p<0.05）。
　　研究結(jié)論:
　　1. Porf-2基因沉默能夠促進體外NSCs的增殖，Porf-2基因過表達則抑制體外NSCs的增殖。但Porf-2對體外NSCs向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞分化的比例影響不顯著。
　　3. Porf-2降低Rac1活性，抑制Wnt信號通路關(guān)鍵分子--β-catenin的入核過程