重組脂肪氧合酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化及其在小麥粉中的應(yīng)用.pdf

1、脂肪氧舍酶廣泛存在于植物、微生物中，具有強(qiáng)筋和漂白的作用，能夠作為面粉改良劑溴酸鉀和過(guò)氧化苯甲酰的潛在替代物，因而成為目前綠色食品添加劑研究開發(fā)方面的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的面粉改良劑相比，脂肪氧合酶作為新型的面粉改良劑具有安全、營(yíng)養(yǎng)、健康等方面的優(yōu)勢(shì)，但是由于其從各種植物中(如大豆)提取所得到的產(chǎn)量較低，所得產(chǎn)物純度不高等因素的影響，使其在大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用方面難以有較大的突破。
　　 本研究主要對(duì)重組魚腥藻脂肪氧合酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)

2、及其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并展開了重組脂肪氧合酶的酶學(xué)性質(zhì)研究；還對(duì)重組脂肪氧合酶在小麥粉中應(yīng)用進(jìn)行了初步探討。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.脂肪氧合酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)以及培養(yǎng)條件優(yōu)化。將脂肪氧合酶(Lox)基因與大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)載體pET-32a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-ana-Lox，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。并對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)條件進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果表明：誘導(dǎo)濃度為1 g/L，誘導(dǎo)時(shí)間16 h，誘導(dǎo)時(shí)

3、機(jī)為OD600為0.8時(shí)，此時(shí)重組ana-Lox酶活產(chǎn)量為812 U/mL。
　　 2.重組脂肪氧合酶的分離純化及其性質(zhì)研究。重組酶BL21/pET-32a-ana-Lox通過(guò)Ni柱親合層析得到電泳純的脂肪氧合酶蛋白，并研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：通過(guò)對(duì)電泳純的脂肪氧合酶蛋白的測(cè)定，重組酶BL21/pET-32a-ana-Lox比活達(dá)到13.7U×103/mg蛋白，純化倍數(shù)達(dá)到23.3倍，酶活回收率為61.9％，分子量約為6

4、6kDa左右；重組酶最適反應(yīng)pH為6.0，最適反應(yīng)溫度為45℃；重組ana-Lox熱穩(wěn)定性不高；金屬離子Fe2+重組酶有激活作用；Mg2+、Ca2+較弱的激活作用。
　　 3.重組脂肪氧合酶在小麥粉中的應(yīng)用。重組脂肪氧合酶對(duì)小麥粉具有強(qiáng)筋和漂白的作用。重組脂肪氧合酶氧化面團(tuán)中水溶性蛋白和SDS可溶性蛋白中的-SH，面團(tuán)中水溶性蛋白和SDS可溶性蛋白中的-SH分別在其添加量為10 U/g和4 U/g時(shí)達(dá)到最低值；而未被還原的二硫鍵

5、(-S-S-)的量分別在10 U/g和4 U/g時(shí)達(dá)到最高值。同時(shí)，重組脂肪氧合酶還會(huì)促進(jìn)水溶性蛋白和可溶性蛋白間發(fā)生物理或化學(xué)交聯(lián)，面團(tuán)中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白的提取量分別在其添加量為6 U/g、6 U/g、4 U/g、4 U/g時(shí)達(dá)到最大值；與KBrO3的比較研究表明，脂肪氧舍酶氧化速度較快，易于造成對(duì)SDS可溶性蛋白(醇溶蛋白、麥谷蛋白)的過(guò)度氧化，從而使小麥粉得品質(zhì)受影響。脂肪氧合酶對(duì)小麥粉中類胡蘿卜素具有降解作用，