贊比亞浸礦微生物的特性及其在生物浸出系統(tǒng)中的作用.pdf

1、生物冶金是微生物介導(dǎo)的一種工藝過程，近幾十年來被應(yīng)用于從金屬礦石及其精礦中提取某些貴金屬。術(shù)語“生物冶金”包括兩種不同的生物技術(shù):生物浸出和生物氧化。生物浸出指的是將不可溶的金屬礦物（一般以諸如CuS，NiS，和ZnS等硫化物形式存在）轉(zhuǎn)化為可溶狀態(tài)（一般以諸如CuSO4，NiSO4，ZnSO4等硫酸鹽形式存在），并通過后續(xù)提取從此可溶物中分離得到所需金屬（如Cu，Ni，Zn等）。生物氧化則是指將浸礦微生物應(yīng)用于難溶金屬（如金、銀等）的

2、預(yù)處理過程，達(dá)到在氰化物處理含有貴金屬的礦石前除去其中的其他金屬硫化物的目的。生物冶金的處理對(duì)象一般以兩種形式存在:金屬氧化物（如鈾）和金屬硫化物，而且就其含量而言后者更為重要。金屬硫化物就其在酸中的可溶性可分為酸可溶金屬硫化物和酸不可溶金屬硫化物。
　　目前對(duì)這兩種金屬硫化物的生物氧化機(jī)理的研究已獲得了顯著的進(jìn)展，雖然在一些方面仍存在爭(zhēng)議和未解決的問題。目前針對(duì)金屬硫化礦的溶解已有研究者提出兩條代謝途徑:硫代硫酸鹽途徑（針對(duì)酸不

3、可溶金屬硫化物）和多硫化物途徑（針對(duì)酸可溶金屬硫化物）。上述途徑中浸礦微生物主要為浸出提供鐵離子（Fe3+）和氫離子(H+)。這些浸礦微生物大多是原核生物（細(xì)菌和古菌），且具有不同的生理生化特性和相互作用。根據(jù)其最適生長(zhǎng)溫度的不同，浸礦環(huán)境中的微生物主要分為三類:嗜溫菌（多為革蘭氏陰性細(xì)菌），中度嗜熱菌（多為古菌和革蘭氏陽性細(xì)菌）和嗜熱菌（多為古菌）。由于金屬硫化物的溶解主要依賴鐵離子和氫離子，所以認(rèn)為鐵氧化微生物（提供鐵離子）和硫氧化

4、微生物（提供氫離子）是主要的浸礦微生物。與這些微生物存在于同一生境的還有一些異養(yǎng)微生物，這些嗜酸的異養(yǎng)微生物包括原核生物（細(xì)菌和古菌）以及真核生物（真菌）。雖然它們并不直接參與生物浸出，但由于其會(huì)對(duì)主要浸礦微生物產(chǎn)生正面或負(fù)面的影響，也會(huì)影響浸出效率。異養(yǎng)微生物在浸出系統(tǒng)中的一個(gè)重要的作用就是清除諸如有機(jī)酸之類的低分子量有機(jī)物，而這些有機(jī)物對(duì)嗜酸的鐵氧化和硫氧化細(xì)菌具有極高的毒性。由于這些異養(yǎng)微生物強(qiáng)化和提高了對(duì)可溶性有機(jī)物(DOM)極

5、度敏感的浸礦微生物群落的生長(zhǎng)能力，故而異養(yǎng)微生物的存在有利于鐵硫氧化菌的生長(zhǎng)，從而有助于提高生物浸出效率。嗜酸異養(yǎng)微生物對(duì)生物浸出另一個(gè)作用是為自養(yǎng)浸礦微生物提供CO2和亞鐵離子作為其碳源和能源。也有研究發(fā)現(xiàn)異養(yǎng)微生物可以參與生物膜（由胞外多聚物EPS和微生物組成）的形成，一般認(rèn)為生物膜是金屬硫化物溶解反應(yīng)發(fā)生的場(chǎng)所。
　　近幾十年對(duì)微生物解離金屬硫化礦機(jī)制的研究，使人們?cè)诎l(fā)展和優(yōu)化生物冶金技術(shù)方面得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步。然而，生物冶金

6、與其他生物技術(shù)一樣還有許多問題有待解決，其中包括篩選更高效的微生物菌株和微生物群落并優(yōu)化其在浸出過程中的生長(zhǎng)條件。另外，因?yàn)樯镆苯鹬械氖人嵛⑸镆话銓?duì)有機(jī)物的耐受性很低，所以對(duì)其的分離培養(yǎng)也成為生物冶金研究的挑戰(zhàn)之一。
　　因此，我們提出并使用了一種新的、基于微生物相互作用的培養(yǎng)方法來分離和/或純化微生物浸出菌株，并利用此方法從地理位置和環(huán)境條件差別極大的兩處銅礦:謙比稀銅礦（非洲贊比亞）和德興銅礦（亞洲中國）中分離得到了微生物

7、菌株;然后將不同來源的兩類微生物菌株分別作為土著和外來微生物對(duì)兩處銅礦樣品交叉進(jìn)行生物浸出，并比較了其浸出效率。另外，還探究了這些微生物菌株在不同的pH，溫度，重金屬和有機(jī)物等環(huán)境條件下的生長(zhǎng)特性。在施加有機(jī)酸的環(huán)境壓力下，通過比較是否加入（分離到的）酵母菌時(shí)的浸出率，研究了酵母菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)浸礦微生物的活性和浸出效率的影響。
　　本研究的目標(biāo)有:
　　(1)發(fā)展一種用于快速富集、分離和純化嗜酸鐵、硫氧化細(xì)菌的高效的分離培

8、養(yǎng)技術(shù);
　　(2)研究生物冶金環(huán)境中細(xì)菌與酵母菌之間可能存在的相互作用，以及此相互作用對(duì)嗜酸自養(yǎng)菌的生長(zhǎng)和浸出效率的影響;
　　(3)比較土著和外源微生物在生理生化和生物浸出效率方面的差異;
　　為實(shí)現(xiàn)本研究的目的，從贊比亞的一個(gè)堆浸礦堆取樣，并從中分離得到三株浸礦菌和一株酵母菌。其中，酵母菌是由單層培養(yǎng)基平板分離得到的。單層培養(yǎng)基平板是在1.5％(wt/v)瓊脂糖平板中加入2.5mM連四硫酸鹽和0.025％(wt/

9、v) TSB(tryptone soya broth大豆胰蛋白胨肉湯)，之后利用其作為雙層瓊脂糖平板中的下層平板分離嗜酸的鐵、硫氧化微生物。雙層瓊脂糖平板按如下所述方法制備:在濃度為1.5％(wt/v)瓊脂糖溶液中加入25 mM亞鐵離子，2.5mM連四硫酸鹽和0.025％(wt/v) TSB，然后再加入分離得到的酵母菌(0.5-1％ v/v);把上述混合液倒入到培養(yǎng)基平板中形成一薄層，待其凝固后加入滅菌后的培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng)。

10、　　在純化所分離到的培養(yǎng)物后，基于18S rRNA基因及基因轉(zhuǎn)錄間區(qū)(ITS1區(qū)、5.8S基因和ITS2)對(duì)分離到的酵母菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析;基于16SrRNA和gyrB基因?qū)Ψ蛛x得到的細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。分析結(jié)果表明酵母菌為Candida digboiensis sp.，命名為NB;三株細(xì)菌分別為At.ferrooxidans FOX1, At.thiooxidans ZMB和 L.ferriphilum BN。本研究中使用的另外三株

11、細(xì)菌是之前從德興銅礦分離得到的，分別被命名為At.ferrooxidns YTW，At.thiooxidans A02，和 L.ferriphilumYTW315。
　　然后研究了上述所有分離到的菌株在不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)特性，這些條件包括溫度(25-45℃);pH（1.2-3用于細(xì)菌，1.5-8用于酵母菌）;重金屬如鐵離子(濃度0-600 mM)和銅離子(0-70 mM)。通過在不同有機(jī)化合物（如葡萄糖，果糖，胰蛋白胨，蛋白胨，

12、乙酸，丙酸）和無機(jī)物（硫酸亞鐵，單質(zhì)硫，連四硫酸鹽，硫代硫酸鹽，金屬硫化物）中培養(yǎng)這些菌株以確定其碳源和能源。
　　研究了酵母菌C.digboiensis對(duì)浸礦微生物生長(zhǎng)和活性的影響。浸礦細(xì)菌用添加了硫酸亞鐵(25 mM)，單質(zhì)硫(1％ wt/v)，10 mM乙酸和10 mM丙酸的9K培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。通過比較加入與不加入酵母菌C.digboiensis的培養(yǎng)條件下浸礦細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況、鐵氧化和硫氧化效率以及有機(jī)酸的消耗來探究酵母菌C

13、.digboiensis對(duì)浸礦微生物生長(zhǎng)活性的影響。
　　本文還研究了酵母菌EPS（胞外多聚物）對(duì)浸礦微生物鐵氧化和硫氧化效率的影響。將鐵氧化和硫氧化的細(xì)菌在不含EPS和含EPS（未清除胞外多聚物）的酵母菌在9K培養(yǎng)基中進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)基中另外添加硫酸亞鐵或單質(zhì)硫作為能源。通過比較不同培養(yǎng)體系中鐵氧化和硫氧化的效率以研究酵母菌胞外多聚物對(duì)不同浸礦微生物的影響。
　　通過生物浸出實(shí)驗(yàn)探究了酵母菌與浸礦細(xì)菌之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)

14、礦樣采自非洲謙比希(Chambishi)銅礦。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)不同浸出體系以研究酵母菌C.digboiensisNB對(duì)浸出細(xì)菌的生長(zhǎng)、活力及浸出效率的影響:第一個(gè)體系是將浸礦細(xì)菌與酵母菌混合浸出（混合浸出體系）;第二個(gè)體系是只用浸礦細(xì)菌浸出（對(duì)照體系）;第三個(gè)體系是不加微生物的體系，僅加入與前兩個(gè)體系等體積的9K培養(yǎng)基（非生物對(duì)照體系）。然后按照一定時(shí)間間隔測(cè)定這些體系的生物浸出參數(shù)，包括pH、Eh、微生物生長(zhǎng)量、鐵浸出率、銅浸出率和有

15、機(jī)物含量?？傊?，一方面表明了異養(yǎng)微生物對(duì)浸礦微生物群落浸礦效率的影響，另一方面揭示了兩類微生物之間的相互作用。
　　然后用相似的方法以加入乙酸的黃鐵礦作為浸出對(duì)象，來模擬研究酵母菌在礦漿浸出體系中的作用。因?yàn)閷?shí)際浸出體系中往往含有大量的有機(jī)物（可溶有機(jī)物含量超過45％）。實(shí)驗(yàn)操作過程與上述實(shí)驗(yàn)相同，不同之處除浸出對(duì)象外還在浸出體系中加入了10 mM乙酸。
　　本研究最重要的部分是比較土著與外來浸礦微生物對(duì)低品位黃銅礦的浸出。

16、首先，拿分離自謙比稀銅礦（非洲贊比亞）和德興銅礦（亞洲中國）的微生物作為土著細(xì)菌，分別浸出各自相應(yīng)采樣地的低品位黃銅礦礦樣;然后，這兩類細(xì)菌還作為外來浸出細(xì)菌分別用于浸出非采樣地的低品位黃銅礦礦樣。本實(shí)驗(yàn)通過分別加入這些細(xì)菌的純培養(yǎng)和它們的混合培養(yǎng)物來揭示這些細(xì)菌在浸出體系中的作用。另外，除測(cè)定上述浸出體系的浸出參數(shù)之外，也對(duì)各浸出體系的微生物群落組成和浸出后礦渣樣品組成進(jìn)行了檢測(cè)與分析。
　　上述所有研究結(jié)果表明，分離到的酵母菌

17、C.digboiensis NB能利用包括有機(jī)酸在內(nèi)的各種有機(jī)物作為能源與碳源進(jìn)行生長(zhǎng)。酵母菌的這些特性及其對(duì)pH耐受范圍(1.5-8.0)說明其能清除瓊脂糖平板中的有機(jī)物，使瓊脂糖平板上的嗜酸自養(yǎng)細(xì)菌能迅速生長(zhǎng)。由于此酵母菌對(duì)有機(jī)物的高代謝活性，應(yīng)用其同浸礦細(xì)菌進(jìn)行混合培養(yǎng)能將浸礦菌的生長(zhǎng)時(shí)間從2周縮短4-5數(shù)天。另外，與異養(yǎng)原核微生物如Acidiphilium sp.和Acidocella sp.不同，酵母菌C.digboiensi

18、sNB表現(xiàn)出對(duì)連四硫酸鹽(tetrathionate)的高度耐受能力。
　　本研究使用雙層瓊脂糖平板從贊比亞礦樣中分離得到了3株浸出細(xì)菌，并純化了之前從德興分離到的3株細(xì)菌。除了對(duì)銅的耐受力之外，來自不同樣點(diǎn)屬于同一物種的菌株表現(xiàn)出了幾乎相同的生理特性與生物浸出效率:其最適pH均低于2.0，最適生長(zhǎng)溫度在30℃至35℃之間。不僅如此，這些細(xì)菌都能通過氧化亞鐵離子與硫化物分別生成鐵離子和/或H+，并且它們表現(xiàn)出了對(duì)鐵離子和銅離子的高

19、耐受性。目前已知這兩種離子是含銅硫化礦浸出體系中影響微生物生長(zhǎng)的主要抑制因子。另外，這些細(xì)菌都不能利用有機(jī)物進(jìn)行生長(zhǎng)，但它們受有機(jī)物的影響程度有所不同。
　　與所預(yù)測(cè)的一致，這些細(xì)菌均對(duì)有機(jī)酸如乙酸和丙酸非常敏感。本研究發(fā)現(xiàn)酵母菌C.digboiensis NB能提高上述自養(yǎng)細(xì)菌對(duì)有機(jī)酸的耐受能力從而使其在有機(jī)物存在時(shí)生長(zhǎng)。結(jié)合從雙層瓊脂糖平板所得到的結(jié)果，強(qiáng)烈的暗示這兩類微生物的共同生長(zhǎng)不是偶然的，而是存在互惠關(guān)系。對(duì)加入或不加

20、入酵母菌的浸出菌株對(duì)低品位硫化銅礦物生物浸出研究結(jié)果的比較進(jìn)一步驗(yàn)證了該假設(shè)，在加入了酵母菌C.digboiensis NB的浸出體系中浸出率提高了8.7％。其實(shí)，酵母菌能利用自養(yǎng)菌產(chǎn)生的有機(jī)物進(jìn)行生長(zhǎng)，避免了有機(jī)物在浸出體系中的積累，從而在一定程度上促進(jìn)了嗜酸鐵氧化和硫氧化細(xì)菌的活力和提高了浸出效率。另外，酵母菌降解有機(jī)物形成的胞外多聚物具有一定的表面活性，能夠改變硫與液體培養(yǎng)基之間的表面張力，最終有助于硫氧化細(xì)菌吸附在硫粒子表面。<

21、br>　　為了模擬酵母菌在處理含重金屬污泥中的作用，本實(shí)驗(yàn)用酵母菌對(duì)含大量有機(jī)酸的黃鐵礦進(jìn)行浸出，顯著提高了浸出效率。對(duì)照體系（只含有浸礦細(xì)菌的浸出體系）和混合浸出體系中鐵離子浸出率在24小時(shí)后分別為6.1％和82.3％。表明酵母菌C.digboiensis與浸礦細(xì)菌混合后能成功應(yīng)用于去除污泥中的重金屬，以利于后續(xù)處理。
　　本研究中特定的浸出菌株組合（分別分離自德興和贊比亞）表現(xiàn)出了幾乎一致的生理特性和浸出效率，且從贊比亞分離到

22、的菌株在生理特性方面稍顯優(yōu)勢(shì)。另外，從德興分離到的菌株比從贊比亞分離到的菌株對(duì)德興礦樣的浸出效率更高，反之亦然。從贊比亞和德興分離到的群落在浸出贊比亞礦樣時(shí)浸出率分別為89％和84％。該結(jié)果表明合適的生理和生化條件是一個(gè)浸礦菌株應(yīng)用于生物浸出所必需的，但這還不足以得到最高的浸出率。在一個(gè)復(fù)雜的浸出體系中，有許多因素會(huì)對(duì)浸出率產(chǎn)生影響，微生物的浸出潛力只是其中一個(gè)影響因素。在浸出含銅硫化礦物時(shí)，盡量使用土著微生物是提高生物浸出效率的一個(gè)較

23、好的方案。
　　綜上所述，
　　(1)本研究從謙比稀銅礦（非洲贊比亞）堆浸現(xiàn)場(chǎng)分離到一株酵母菌C.digboiensis NB，由于其能利用不同種類的有機(jī)物進(jìn)行生長(zhǎng)，可應(yīng)用于分離和純化浸礦微生物;
　　(2)酵母菌C.digboiensis NB有助于鐵氧化和硫氧化細(xì)菌在有機(jī)物壓力條件下生長(zhǎng);
　　(3)通過消除浸出體系中的有機(jī)物，避免其對(duì)浸礦微生物的毒性作用，酵母菌C.digboiensis NB能顯著提高微生

24、物的浸礦效率;
　　(4)在浸出類似于含大量重金屬的污泥時(shí)，酵母菌C.digboiensisNB能更顯著提高浸出率（在本研究中用含有大量乙酸的黃鐵礦作為對(duì)象來模擬污泥）;
　　(5)酵母菌C.digboiensis NB的胞外多聚物有助于微生物菌株吸附在諸如單質(zhì)硫粒子等疏水粒子表面;
　　(6)最后，通過比較來源于謙比稀銅礦和德興銅礦的微生物菌株在浸礦時(shí)的表現(xiàn)，表明土著微生物群落在浸出效率方面比外來微生物群落要高。在浸