基于金納米復(fù)合材料固載[Ru(phen)3]2+及其衍生物構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器的研究.pdf

1、電致化學(xué)發(fā)光傳感器具有選擇性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、易于便攜、并且還易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣大研究者的關(guān)注。用適體作為電致化學(xué)發(fā)光傳感器的識(shí)別元件構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器是融合生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、信息科學(xué)及相關(guān)技術(shù)于一體，是目前發(fā)展十分活躍的研究領(lǐng)域。電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器中發(fā)光體系的選擇和固載對(duì)于實(shí)現(xiàn)傳感器的超靈敏監(jiān)測(cè)，提高傳感器的穩(wěn)定性、選擇性等都具有重要的意義。針對(duì)常用的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)探針金屬釕配合物水溶性強(qiáng)、分子結(jié)

2、構(gòu)無(wú)官能團(tuán)可共價(jià)交聯(lián)而難于固載標(biāo)記的缺點(diǎn)，本文利用納米材料作為固載基質(zhì)，用吸附、摻雜或堆積等方法來(lái)固載發(fā)光試劑，提高發(fā)光試劑的固載量，以增強(qiáng)發(fā)光效率;設(shè)計(jì)合成了含羧基的[Ru(phen)2(cpaphen)]2+配合物，通過(guò)共價(jià)鍵作用將共反應(yīng)試劑與鄰菲羅啉釕交聯(lián)在一個(gè)分子內(nèi)，得到自增強(qiáng)的發(fā)光試劑，從而提高其發(fā)光效率，用于構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器。本論文的研究工作主要分為以下幾部分:
　　1.基于DNA雙鏈鑲嵌[Ru(phen)3

3、]2+功能化的空心金為標(biāo)記構(gòu)建信號(hào)增強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光凝血酶適體傳感器
　　基于DNA鏈雜交反應(yīng)形成超夾心結(jié)構(gòu)用來(lái)固載發(fā)光試劑作為信號(hào)放大策略，結(jié)合空心金納米顆粒大的比表面積、優(yōu)良的導(dǎo)電性能等優(yōu)點(diǎn)作為信號(hào)標(biāo)簽，構(gòu)建電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。在這里，空心金納米顆粒由于具有大的比表面積以及好的導(dǎo)電性能用于標(biāo)記凝血酶適體Ⅱ，然后用親和素(SA)以封閉空心金納米顆粒表面的特異性活性位點(diǎn)，這樣就可以引入大量標(biāo)記了生物素的DNA鏈

4、(Bio-S1)，在ssDNA2(S2)和ssDNA3(S3)存在時(shí)，這些部分互補(bǔ)配對(duì)DNA短鏈會(huì)自發(fā)的發(fā)生鏈雜交反應(yīng)，形成超夾心的DNA雙鏈，利用靜電吸附作用，雙鏈DNA可以固載大量的[Ru(phen)3]2+，從而加大了發(fā)光試劑的固載量，起到信號(hào)放大的作用。在目標(biāo)物凝血酶存在的情況下，適體Ⅰ和適體Ⅱ可以通過(guò)夾心結(jié)構(gòu)將適體Ⅱ復(fù)合物固載到Au@Pb納米復(fù)合材料修飾的電極表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的檢測(cè)。該方法利用超夾心結(jié)構(gòu)固載[Ru(phen)

5、3]2+，不僅解決了發(fā)光試劑[Ru(phen)3]2+不容易固載的缺點(diǎn)，又增加其固載量;同時(shí)利用空心納米金的大的比表面積增加了DNA的固載量，進(jìn)一步增加了發(fā)光試劑的固載量，從而放大了檢測(cè)信號(hào)，提高了適體傳感器的檢測(cè)性能。結(jié)果顯示，該適體傳感器在5 fmol L-1至50 pmol L-1范圍內(nèi)對(duì)凝血酶有較好的線性響應(yīng)，檢測(cè)限為1.6 fmolL-1(S/N=3)。
　　2.基于非共價(jià)鍵結(jié)合的[Ru(phen)3]2+@CNTs納米

6、復(fù)合材料作為信號(hào)探針在固態(tài)電致化學(xué)發(fā)光傳感器的應(yīng)用
　　利用非共價(jià)鍵的π-π疊加作用制備了[Ru(phen)3]2+包裹碳納米管([Ru(phen)3]2+@CNTs)納米復(fù)合材料構(gòu)建簡(jiǎn)單的無(wú)標(biāo)記電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器用于檢測(cè)凝血酶。在實(shí)驗(yàn)中，我們利用簡(jiǎn)單有效的π-π疊加作用將Ru(phen)3]2+堆積在CNTs表面，制得了[Ru(phen)3]2+@CNTs納米復(fù)合材料。然后利用Nafion好的成膜性作為[Ru(phen)3]

7、2+@CNTs納米復(fù)合材料分散劑，將其固定在玻碳電極表面做為電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)探針。利用靜電吸附作用將空心金納米顆粒(HGNPs)吸附到電極表面用于固定凝血酶適體(TBA)。當(dāng)傳感器與目標(biāo)物凝血酶孵育時(shí)，惰性的凝血酶蛋白通過(guò)適體的特異性選擇作用組裝到電極表面，由于蛋白的阻抗作用導(dǎo)致電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低，從而可以檢測(cè)凝血酶的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，傳感器的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)變化與凝血酶濃度的對(duì)數(shù)在20 nmol L-1到1 pmol L-1的范圍

8、內(nèi)成線性關(guān)系，檢出限達(dá)到0.33 pmol L-1。此外，我們用電子掃描顯微鏡以及紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)探討了納米材料成功制備的可能性。這項(xiàng)工作主要從發(fā)光試劑的固載方法上提供了新的方法，從而也擴(kuò)展了CNTs的應(yīng)用范圍。
　　3.基于釕(Ⅱ)聯(lián)氨芐西林為識(shí)別元件構(gòu)建ECL生物傳感器用于β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)
　　在這項(xiàng)工作中，利用合成的含羧基支鏈的鄰菲羅啉釕共價(jià)連接氨芐西林(Ru-Amp)作為新穎的特定的β-內(nèi)酰胺酶識(shí)別元件，構(gòu)造一

9、個(gè)簡(jiǎn)單、靈敏的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶的濃度。在這里，Ru-Amp配合物不僅可以作為β-內(nèi)酰胺酶特異性識(shí)別元件，同時(shí)又作為體系的發(fā)光物質(zhì)。首先，我們用3-噻吩丙二酸(TA)還原的納米金(TA@AuNPs)作為信號(hào)探針的固載基質(zhì)，該納米金材料表面不僅帶有大量的負(fù)電荷，還具有π鍵結(jié)構(gòu)，不僅可以通過(guò)靜電吸附固載Ru-Amp配合物，還可以通過(guò)Ru-Amp分子的π鍵結(jié)構(gòu)通過(guò)非共價(jià)鍵的π-π疊加作用結(jié)合起來(lái)，從而可以將大量的Ru-Am

10、p固定到TA@AuNPs表面，得到的Ru-Amp/TA@AuNPs納米復(fù)合材料。該納米復(fù)合材料，不僅在試劑方面表現(xiàn)出優(yōu)異的電致化學(xué)發(fā)光的行為，還在電極表面可以產(chǎn)生非常穩(wěn)定的膜，容易實(shí)現(xiàn)固體電極的制備。當(dāng)目標(biāo)物β-內(nèi)酰胺酶存在時(shí)，傳感器的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)會(huì)明顯增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。該生物傳感器對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的濃度變化范圍從50 pg mL-1-100 ng mL-1，檢測(cè)限為37 pgmL-1。該傳感器為設(shè)計(jì)多樣化的電致化

11、學(xué)發(fā)光傳感器提供了新的思路。
　　4.β-內(nèi)酰胺酶催化水解原位生成自增強(qiáng)發(fā)光物質(zhì)用于構(gòu)建凝血酶適體傳感器
　　基于β-內(nèi)酰胺酶的水解催化原位生成自增強(qiáng)的發(fā)光試劑作為信號(hào)放大策略構(gòu)建的超靈敏的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。首先，設(shè)計(jì)合成了一種新的發(fā)光試劑，該化合物包含兩部分，一部分為發(fā)光試劑[Ru(phen)2(cpaphen)]2+，一部分為含氨基的氨芐西林(Amp)，其可以對(duì)釕的發(fā)光起到一定的促進(jìn)作用。將這兩部分

12、用N-羥基琥珀酰亞胺和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙烯碳二亞胺-鹽酸鹽交聯(lián)劑交聯(lián)起來(lái)，得到[Ru(phen)2(cpaphen)]2+-Amp(Ru-Amp)配合物，其可以通過(guò)分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)整個(gè)分子的電致化學(xué)發(fā)光性能，也即自增強(qiáng)的發(fā)光試劑。然后利用非共價(jià)鍵的π-π疊加作用將Ru-Amp與碳納米管結(jié)合在一起得到Ru-Amp@CNTs復(fù)合納米材料，利用聚乙烯亞胺(PEI)作為交聯(lián)劑將Ru-Amp@CNTs復(fù)合納米材料連接在金

13、納米籠(AuNCs)表面，得到Ru-Amp@CNTs-AuNCs復(fù)合材料。最后利用Au-S鍵將適體Ⅱ(TBAⅡ)連接到Ru-Amp@CNTs-AuNCs復(fù)合材料上，制備了適體Ⅱ的復(fù)合生物復(fù)合材料(Ru-Amp@CNTs-PEI-AuNCs-TBAⅡ)。在目標(biāo)物凝血酶存在時(shí)，通過(guò)夾心結(jié)構(gòu)，適體Ⅰ-凝血酶-適體Ⅱ的作用，將適體Ⅱ的復(fù)合生物材料固載到dpAu/Nafion-GR修飾的玻碳電極表面。當(dāng)修飾電極孵育了β-內(nèi)酰胺酶后，由于β-內(nèi)酰胺

14、酶對(duì)氨芐西林特異性的催化水解作用，將Ru-Amp中氨芐西林部分的酰胺基團(tuán)打開(kāi)生成了仲胺，生成的仲胺能夠更進(jìn)一步的通過(guò)分子內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移促進(jìn)釕的電致化學(xué)發(fā)光，得到了信號(hào)放大的凝血酶適體傳感器。該傳感器具有好的穩(wěn)定性和靈敏度，在1.0 fmol L-1-1.0 pmol L-1范圍內(nèi)檢測(cè)凝血酶，檢測(cè)下限為0.33 fnol L-1。由自增強(qiáng)的發(fā)光試劑結(jié)合酶催化放大技術(shù)構(gòu)建傳感器的方法有望在生物技術(shù)和臨床應(yīng)用上有一定的借鑒作用。
　　5.

15、基于水凝膠金納米復(fù)合材料作為信號(hào)探針構(gòu)建signal-on的凝血酶適體傳感器
　　基于自組裝水凝膠金納米復(fù)合材料（內(nèi)含釕配合物的電致化學(xué)發(fā)光基團(tuán)）作為信號(hào)探針，聚乙烯亞胺還原樹(shù)枝狀納米金(PEI-DAuNPs)作為共反應(yīng)試劑制備了靈敏的電致化學(xué)發(fā)光適體傳感器用于檢測(cè)凝血酶(TB)的濃度。首先用交聯(lián)劑N-羥基琥珀酰亞胺和N-（3-二甲基氨基丙基）-N-乙烯碳二亞胺-鹽酸鹽將含氨基的N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(NAMM)和含有-

16、COOH基團(tuán)的電致化學(xué)發(fā)光體[Ru(phen)2(cpaphen)]2+配合物交聯(lián)起來(lái)，所得到的化合物具有電致化學(xué)發(fā)光特性，還可以作為水凝膠聚合反應(yīng)的單體。另外，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺還可以通過(guò)Au-N鍵與金納米顆粒連接作為聚合物的另一單體。通過(guò)自由基聚合反應(yīng)，得到了具有發(fā)光基團(tuán)的自組裝的水凝膠金納米復(fù)合材料(pNAMM-Ru-HGNPs)。該水凝膠金納米復(fù)合材料被用做載體有效的固載凝血酶適體Ⅱ(TBAⅡ)從而成功制備了水凝膠

17、適體Ⅱ復(fù)合生物材料(pNAMM-Ru-HGNPs-TBAⅡ)。用聚乙烯亞胺還原納米金是帶正電荷的，其可以通過(guò)靜電吸附固載在CNTs-Nf修飾電極上，不僅用于捕獲凝血酶適體Ⅰ，還可以將共反應(yīng)試劑固載在電極表面。最后在凝血酶存在的條件下，利用夾心模型，適體Ⅰ-凝血酶-適體Ⅱ的作用，將凝膠適體Ⅱ的復(fù)合生物材料固載到修飾電極表面，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血酶的檢測(cè)。利用聚合反應(yīng)制備的水凝膠能夠有效的固載更多的釕發(fā)光試劑，結(jié)合PEI-DAuNPs作為共反應(yīng)