全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑的構(gòu)建及其在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用.pdf

1、綠色化工的興起為高效率、低能耗、低排放生產(chǎn)化工產(chǎn)品提供了充分保障。生物轉(zhuǎn)化是綠色化工的重要組成部分，脂肪酶由于其催化反應(yīng)及底物類型多樣而在生物轉(zhuǎn)化中扮演了重要角色。目前應(yīng)用的脂肪酶主要是游離型脂肪酶或基質(zhì)固定化脂肪酶。近年來，全細(xì)胞生物催化劑做為降低酶催化劑成本的最有前景的方法之一，引起研究工作者的重視。酵母展示表達系統(tǒng)構(gòu)建的全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑由于使酶分子成為細(xì)胞壁的一部分并且展示在細(xì)胞表面，故不僅在活性和穩(wěn)定性方面顯著高于游離酶和

2、基質(zhì)固定化酶，且大大降低了生產(chǎn)成本，可多次重復(fù)利用，為脂肪酶的高效生物轉(zhuǎn)化研究及應(yīng)用提供了有效的途徑。
　　 本論文根據(jù)酵母密碼子偏愛性優(yōu)化設(shè)計脂肪酶ROL和CALB兩個基因，利用釀酒酵母和畢赤酵母表面展示表達系統(tǒng)，用連接肽將脂肪酶與酵母細(xì)胞壁成分α凝集素連接，成功構(gòu)建了4個重組酵母全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑。以釀酒酵母表面展示表達ROL的全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑為例，研究其酶學(xué)性質(zhì)、水相油脂水解應(yīng)用、非水相生物柴油合成應(yīng)用及分子印跡

3、法的影響等方面展開研究工作，并得出以下主要結(jié)論：
　　 1，三丁酸甘油酯平板水解圈法鑒定陽性克隆及液體培養(yǎng)基發(fā)酵上清液測定無脂肪酶活性，證明了釀酒酵母表面展示表達ROL的全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑構(gòu)建成功。據(jù)我們所知，這是首次報道α凝集素釀酒酵母展示表達系統(tǒng)與密碼子優(yōu)化技術(shù)結(jié)合，從而獲得了高酶活的全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑。其水解酶活為25±0.89 U/g干細(xì)胞，最適溫度40℃，最適pH7.0，酯化酶活為5.12 U/g干細(xì)胞。

4、>　　 2，以水解三丁酸甘油酯為例，研究了全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑的水解應(yīng)用。證實全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑在水相中有很強的水解能力，144小時丁酸的轉(zhuǎn)化率達到96.91％。未來將可以嘗試應(yīng)用于各種有酯鍵結(jié)構(gòu)的底物水解。
　　 3，首次報道將分子印跡技術(shù)和全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑結(jié)合，顯著提高了全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑在有機相中的催化活性和熱穩(wěn)定性。在有機相油酸甲酯的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，分子印跡法制備的全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑轉(zhuǎn)化率為96.3

5、0%，是非分子印跡組的2倍(50.32%)。分子印跡技術(shù)使脂肪酶的催化活性中心在有機相中保持活化狀態(tài)，極大提高了催化效率。而在水相中，分子印跡法制備全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑對其水解活性和熱穩(wěn)定性提高不顯著。
　　 4，分子印跡法制備的全細(xì)胞脂肪酶生物催化劑成功應(yīng)用于生物柴油的生物轉(zhuǎn)化試驗，在有機相中大豆油轉(zhuǎn)化成生物柴油，轉(zhuǎn)化率為77.71%，是非分子印跡組的5倍(15.46%)。進一步證明了分子印跡技術(shù)在有機相中可顯著提高全細(xì)胞脂