基于代謝調(diào)控提高克雷伯菌HQ-3利用有機廢棄物生產(chǎn)氫氣的研究.pdf

1、隨著石化能源枯竭、環(huán)境污染和資源匱乏等問題的日益突出,氫能作為一種環(huán)境友好的可替代能源受到了人們的普遍關注。暗發(fā)酵制氫具有產(chǎn)氫速度快、反應條件溫和、設備簡單,以及能夠利用可再生有機廢棄物等特點,具有廣闊發(fā)展前景,成為目前生物制氫的重要研究方向。然而,野生菌的產(chǎn)氫效率低,發(fā)酵成本高等缺陷一直制約著暗發(fā)酵制氫的工業(yè)化。為此,研究產(chǎn)氫機理和調(diào)控產(chǎn)氫代謝相關途徑成以提高厭氧暗發(fā)酵細菌產(chǎn)氫能力成為當前研究熱點?？死撞哂幸子谂囵B(yǎng)、底物適應性強、

2、產(chǎn)氫效率高等優(yōu)點,具有厭氧產(chǎn)氫潛力。本研究以克雷伯野生菌Klebsiellasp.HQ-3及本實驗室已構建的敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的工程菌HQ-3-P為出發(fā)菌株,通過過表達甲酸氫裂解途徑、NADH途徑中的正向調(diào)控因子和輔酶因子,構建高效重組菌株,并對產(chǎn)氫效率最高的重組菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。此外,還探討了以油脂抽提藻渣的酶解液為碳源暗發(fā)酵產(chǎn)氫。為進一步開發(fā)基于克雷伯菌暗發(fā)酵產(chǎn)氫提供有益探索。主要研究內(nèi)容和結果摘要如下:<

3、br>　　1.構建同源過表達代謝調(diào)控因子和輔酶因子的高效重組菌。以克雷伯菌Klebsiellasp.HQ-3基因組DNA為模板,擴增得到甲酸氫裂解酶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活蛋白(FHLA)fhlA基因、全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(FNR)fnr基因、甲酸脫氫酶(FDH-H)fdhF基因,以及NADH途徑中編碼煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶(NAPRTase)的pncB基因。連接改造后的表達載體pET28a-Pkan,構建重組質(zhì)粒pET28a-Pkan-fhlA、pET

4、28a-Pkan-fnr、pET28a-Pkan-fdhF、pET28a-Pkan-pncB,分別電轉(zhuǎn)至野生菌株HQ-3及工程菌HQ-3-P中,獲得8種重組菌。利用氣相色譜檢測重組菌產(chǎn)氫特性。與野生菌HQ-3相比,HQ-3-fdhF、HQ-3-pncB、HQ-3-fnr、HQ-3-fhlA的產(chǎn)氫效率分別提高了7.28％、11.62%、12.26%、15.45%;HQ-3-P/fdhF、HQ-3-P/pncB、HQ-3-P/fnr、HQ-

5、3-P/fhlA與出發(fā)菌株HQ-3-P相比,分別提高了12.33%、15.58%、19.13%、29.35%。
　　2.重組菌HQ-3-P/fhlA發(fā)酵條件的優(yōu)化。選擇對產(chǎn)氫發(fā)酵影響較顯著的接種量、溫度和初始pH三種因素進行單因素優(yōu)化,實驗結果顯示,菌體最佳接種量為20%、最適溫度為33°C、最適初始pH為6.5。利用CCD-RSM對氫氣產(chǎn)量進一步響應面優(yōu)化,發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳工藝條件為:接種量21.26%,溫度31.75°C,初始p

6、H6.67。在此條件下,實驗驗證產(chǎn)氫量為3.214molH2/mol葡萄糖,與預測值3.236molH2/mol葡萄糖非常接近,回歸方程比較準確地預測了各因素的影響。
　　3.油脂抽提藻渣(LMBRs)預處理發(fā)酵產(chǎn)氫的初步研究。藻渣纖維素“預處理-酶解法”采用超聲、稀HCl、稀NaOH、氨水浸泡預處理,中和后,再以纖維素酶處理。經(jīng)過不同預處理的還原糖得率以熱堿結合纖維素酶法效果最佳,并在發(fā)酵制氫中氫累積量也最高,達到652mL/L