畢赤酵母糖基工程改造及WFDC2生物學(xué)活性的探討.pdf

1、甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)近年來被廣泛用于外源蛋白的大規(guī)模表達(dá)和生產(chǎn)，但其對(duì)重組蛋白的糖基化修飾與哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的復(fù)雜型糖鏈有著明顯區(qū)別。畢赤酵母合成的糖蛋白為30-50個(gè)甘露糖修飾的高甘露糖型蛋白，此類糖蛋白由于末端甘露糖修飾而容易被清除，導(dǎo)致體內(nèi)半衰期縮短，對(duì)藥理學(xué)性質(zhì)包括生物學(xué)活性、受體結(jié)合力、抗體效應(yīng)作用、藥代動(dòng)力學(xué)和免疫原性都有一定的影響，從而限制了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在藥用重組糖蛋白的表達(dá)應(yīng)用。為了改善畢赤酵母對(duì)蛋白的過度糖基

2、化修飾，需要對(duì)畢赤酵母的N-糖基化途徑進(jìn)行改造。本研究的第一部分是根據(jù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的N-糖基化途徑對(duì)畢赤酵母的N-糖基化途徑進(jìn)行一系列改造，從而獲得能夠產(chǎn)生低糖基化雜合型糖鏈GlcNAcMan5GlcNAc2-Asn修飾的工程菌株。
　　α-1,6甘露糖轉(zhuǎn)移酶(OCH1)是畢赤酵母糖基化途徑中區(qū)別于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的第一個(gè)關(guān)鍵酶，該酶識(shí)別Man8GlcNAc2的糖鏈末端并添加α-1,6-甘露糖形成Man9GlcNAc2寡糖連，

3、然后以此寡糖作為底物繼續(xù)添加-系列甘露糖，最終形成高甘露糖型。所以α-1,6甘露糖轉(zhuǎn)移酶(OCH1)是導(dǎo)致高甘露糖型生成的關(guān)鍵酶，要阻斷畢赤酵母的過度糖基化修飾，必須對(duì)OCH1基因進(jìn)行敲除，作為畢赤酵母糖基工程改造的起始步驟。首先以野生型畢赤酵母KM71作為起始菌株，建立了MazF-ZeoR兩步基因重組敲除OCH1基因的方法。利用MazF-ZeoR篩選標(biāo)記和兩步基因重組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了博萊霉素(zeocin)的循環(huán)使用。最終結(jié)合基因型和表型

4、篩選獲得了α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶OCH1基因敲除的工程菌株，糖鏈分析發(fā)現(xiàn)其高甘露糖修飾和不均一性明顯降低，85％的糖鏈為Man8GlcNAc2糖型，說明Pichia Pastoris的過度糖基化被阻斷。
　　當(dāng)具有Man8GlcNAc2寡糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白進(jìn)入高爾基體后，位于高爾基體的α-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ對(duì)其進(jìn)行剪切而形成Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)的糖鏈，該糖型是形成雜合型糖鏈的中間糖型。在畢赤酵母內(nèi)合成具有此結(jié)構(gòu)糖鏈的糖蛋白，

5、需要引入外源的α-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ來實(shí)現(xiàn)。本研究選擇在精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的畢赤酵母菌株內(nèi)表達(dá)綠色木霉來源的α-1,2-甘露糖苷酶Ⅰ（MnsⅠ），使用釀酒酵母a交配因子替換其自身信號(hào)肽，該基因在C端融合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列HDEL后轉(zhuǎn)化入畢赤酵母Koch1(⊿och1)工程菌株中表達(dá)，糖鏈分析結(jié)果顯示68％糖型為Man5GlcNAc2中間結(jié)構(gòu)，表明綠色木霉MnsⅠ能夠在畢赤酵母中發(fā)揮糖苷酶活性。
　　內(nèi)側(cè)高爾基體形成的Man5GlcNAc

6、2糖鏈轉(zhuǎn)入中間高爾基體后，在β-1,2-N-乙酰葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(GnTⅠ)的作用下生成雜合型糖鏈GlcNAcMan5GlcNAc2，然后進(jìn)入外側(cè)高爾基體，進(jìn)一步形成復(fù)雜型糖鏈，完成哺乳動(dòng)物雙天線復(fù)雜型N-糖鏈的合成。為了實(shí)現(xiàn)β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(GnTⅠ)的表達(dá)需要引入外源的GnTⅠ，本研究將人源GnTⅠ自身定位信號(hào)用釀酒酵母高爾基體定位信號(hào)mnn9取代后，在畢赤酵母KMoch1(⊿och1，+mds)中表達(dá)，對(duì)報(bào)告蛋白

7、的糖鏈分析結(jié)果表明人源β-1,2-N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(GnTⅠ)在畢赤酵母中成功表達(dá)，具有催化活性，催化效率為91％，最終成功獲得了能夠合成雜合型糖鏈GlcNAcMan5GlcNAc2-Asn的工程菌株。
　　第二部分是以第一部分的工作為基礎(chǔ)，建立了高效表達(dá)WFDC2(whey acidicprotein four-disulfide)重組蛋白的工程菌株，并探討不同糖基化修飾的WFDC2蛋白的生物活性的影響。WFDC2蛋白是

8、由124個(gè)氨基酸組成的小分子分泌性糖蛋白，作為本研究N-糖基化改造的報(bào)告蛋白。該蛋白是由兩個(gè)高度保守的乳清蛋白WAP結(jié)構(gòu)域組成，具有該結(jié)構(gòu)的蛋白可能具有抑菌活性和蛋白酶抑制作用，但WFDC2的生物活性尚未研究報(bào)道。本研究首先對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞293F表達(dá)的WFDC2蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性研究，然后以其作為對(duì)照，對(duì)末端不同糖基化修飾（高甘露糖型、雜合型和復(fù)雜型）的WFDC2進(jìn)行生物學(xué)活性探索和對(duì)比研究。結(jié)果顯示W(wǎng)FDC2與多種微生物有一定的親和作

9、用，其中與金黃色葡萄球菌的親和力較強(qiáng)，對(duì)其生長(zhǎng)有微弱的抑制作用;WFDC2蛋白對(duì)多種蛋白酶均有一定的抑制作用，包括絲氨酸蛋白酶（胰酶和彈性蛋白酶）、基質(zhì)金屬蛋白酶和枯草桿菌分泌的蛋白酶，對(duì)MMP9的抑制作用較強(qiáng)。末端為高甘露糖型和雜合型糖基化修飾的WFDC2蛋白的生物學(xué)活性（包括對(duì)枯草蛋白酶、絲氨酸蛋白酶的抑菌作用）降低，其中末端為雜合型糖基化修飾的WFDC2蛋白(KMoGnTⅠ-WFDC2)對(duì)胰酶的抑制作用與哺乳動(dòng)物細(xì)胞293F表達(dá)的

10、WFDC2蛋白活性相近，說明末端糖鏈的組成對(duì)蛋白的生物活性產(chǎn)生一定的影響。
　　綜上所述，經(jīng)過對(duì)畢赤酵母的糖基工程改造，最終獲得具有自主產(chǎn)權(quán)的，能夠產(chǎn)生雜合型GlcNAcMan5GlcNAc2-Asn糖型的工程菌株KMoGnTⅠ，為進(jìn)一步合成復(fù)雜型糖基提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);同時(shí)首次在體外發(fā)現(xiàn)WFDC2具有蛋白酶抑制作用，并對(duì)末端不同糖基化修飾對(duì)WFDC2蛋白生物活性的影響進(jìn)行探討，對(duì)于了解WFDC2的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，及在生理病理中的作用