宏基因組甘油脫水酶及1,3-丙二醇氧化還原酶基因的克隆、協(xié)同表達(dá)與發(fā)酵研究.pdf

1、1，3-丙二醇(1，3-propanediol，簡(jiǎn)稱(chēng)1，3-PD)作為一種重要的化工原料，是目前國(guó)際上公認(rèn)的六大石化新產(chǎn)品之一，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用。生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)1，3-PD具有非常顯著的優(yōu)勢(shì)，是目前研究的熱點(diǎn)。甘油脫水酶(GDHt，由dhaBCE基因編碼)和1，3-丙二醇氧化還原酶(PDOR，由dhaT基因編碼)作為生物法生產(chǎn)1，3-PD的關(guān)鍵酶和限速酶，也受到廣泛的關(guān)注和研究。
　　本論文從甘油富集培養(yǎng)區(qū)

2、和甘油廠的下水道附近取樣，取回后對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，提取其宏基因組DNA。分別設(shè)計(jì)了GDHt和PDOR編碼基因保守區(qū)域的簡(jiǎn)并引物，并以此宏基因組DNA為模板，優(yōu)化擴(kuò)增條件后，獲得了4個(gè)GDHt和2個(gè)PDOR編碼基因保守區(qū)域序列。經(jīng)測(cè)序分析顯示，其中保守區(qū)域序列BCE1長(zhǎng)930bp，與克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumonia)的GDHt編碼基因相似性為99％;保守區(qū)域序列BCE2長(zhǎng)772bp，與產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostri

3、dium perfringens)的GDH編碼基因相似性為97％;保守區(qū)域序列BCE3長(zhǎng)646bp，與克氏檸檬酸桿菌(Citrobacterkoseri)的假定蛋白編碼基因相似性達(dá)88％，經(jīng)生物信息學(xué)分析，此假定蛋白編碼基因很可能就是GDHt的編碼基因;保守區(qū)域序列BCE4長(zhǎng)438bp，與未培養(yǎng)細(xì)菌(Uncultured bacterium)的GDHt編碼基因相似度為99％;保守區(qū)域序列T1長(zhǎng)1100bp，該序列與肉毒梭狀芽孢桿菌(Cl

4、ostridium botulinum)的PDOR編碼基因相似性達(dá)87％;保守區(qū)域序列T2長(zhǎng)1100bp，與C.perfringens的PDOR編碼基因的相似性達(dá)99％。
　　以宏基因組DNA為模板，在保守區(qū)域序列BCE2和T2生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，克隆了dhaBCE2和dhaT2的全長(zhǎng)基因，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-dhaBCE2和pET-dhaT2，通過(guò)化學(xué)法分別將它們轉(zhuǎn)化到E.coli Rosetta(DE3)中，獲得E.

5、coli-pET-dhaBCE2和E.coli-pET-dha T2的重組菌株。蛋白質(zhì)電泳分析表明，重組GDHt分別在64 kDa、23 kDa和19 kDa位置有明顯的的特征蛋白條帶出現(xiàn);重組PDOR在45 kDa位置有明顯的的特征蛋白條帶出現(xiàn)，重組GDHt與PDOR蛋白質(zhì)電泳與預(yù)期結(jié)果相符。GDHt酶學(xué)性質(zhì)分析表明，以1，2-PD為底物，GDHt的最適pH為9.2，最適反應(yīng)溫度為42℃，其對(duì)甘油、1，2-PD和CoB12的Km分別為

6、0.8mmol/L、1.33mmol/L、6.5mmol/L，其對(duì)甘油及1，2-PD的比活力分別為97U/mg和78U/mg。PDOR酶學(xué)性質(zhì)分析表明，以丙醛為底物，PDOR還原反應(yīng)的最適pH為7.5，最適溫度為37℃，對(duì)丙醛的Km值為2.14mmol/L，比活力為29.5U/mg;以1，3-PD為底物，PDOR氧化反應(yīng)最適反應(yīng)pH為9.0，最適反應(yīng)溫度為25℃，對(duì)1，3-PD的Km值為1.75 mmol/L，比活力為16.9U/mg。

7、
　　以重組質(zhì)粒pET-dhaBCE2和pET-dhaT2為模板，利用具有RBS序列的串聯(lián)表達(dá)引物分別擴(kuò)增出dhaBCE2和dhaT2基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-dhaBCE2-dhaT2。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta(DE3)宿主菌，獲得GDHt和PDOR編碼基因協(xié)同表達(dá)的重組菌株E.coli-dhaBCE2-dha T2。蛋白質(zhì)電泳分析表明，重組菌株在64 kDa，23 kDa，19 kDa及45 kDa有特征條帶

8、出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了dhaBCE2和dhaT2基因的協(xié)同表達(dá)。將該重組菌株在含20g/L甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)1，3-PD試驗(yàn)，氣相色譜分析結(jié)果表明，發(fā)酵液中有1，3-PD的產(chǎn)生，產(chǎn)量約為11.3g/L，協(xié)同表達(dá)重組菌得到了成功構(gòu)建。
　　本論文通過(guò)分子生物學(xué)方法從特殊樣品來(lái)源的宏基因組中獲得了多個(gè)GDHt和PDOR編碼基因保守區(qū)域，豐富了GDHt和PDOR的基因資源;分別克隆并協(xié)同表達(dá)了宏基因組的dhaBCE2和dhaT2基