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文檔簡介
1、骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OS)是一種以骨代謝異常為特征的系統(tǒng)性骨病,代謝異常導(dǎo)致骨的再生能力下降,進而產(chǎn)生延遲愈合、骨不連,甚至引起骨缺損。在骨質(zhì)疏松癥的診療方面,全球范圍內(nèi)投入的醫(yī)療費用及社會資源非常可觀,而且伴隨著世界人口老齡化的步伐,這種投入還在繼續(xù)攀升。骨質(zhì)疏松癥合并骨缺損更是困擾臨床工作的難題之一。雖然國內(nèi)外的專家學(xué)者們已經(jīng)開發(fā)出多種類型的組織工程支架,但是目前尚未找到一種理想的支架。
理想的組織工程支
2、架應(yīng)該達到以下要求:支架應(yīng)具有促進細胞粘附和增殖的能力;支架的降解產(chǎn)物不產(chǎn)生炎癥或毒性;支架應(yīng)能提供合適的機械支撐,以避免細胞被破壞性的壓縮和拉伸;支架應(yīng)能促進細胞成骨分化,以增強骨的再生能力。目前研究較為廣泛的組織工程材料包括:天然有機聚合物:膠原蛋白、纖維蛋白、殼聚糖等;天然無機聚合物:珊瑚羥基磷灰石、陶瓷化骨等;人工合成有機聚合物:聚乳酸、聚羥基乙酸;人工合成聚合物:羥基磷灰石、磷酸三鈣;金屬材料:鈦、鉭等。
殼聚糖是一
3、種堿性氨基多糖,由甲殼素脫乙?;苽涠?,其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類似氨基多糖,而氨基多糖正是細胞外基質(zhì)中的主要成分。殼聚糖的生物相容性良好,而且降解產(chǎn)物無毒性作用,但是作為組織工程支架材料,殼聚糖的缺點在于其力學(xué)性能和成骨能力的不足。力學(xué)性能不足導(dǎo)致其無法為承重部位提供有效的機械支撐,成骨能力不足使其難以應(yīng)用于骨質(zhì)疏松性骨缺損的修復(fù)。為了解決這一問題,許多學(xué)者進行了制備復(fù)合材料的嘗試。Bayer等制備了磷酸鈣與殼聚糖組成的聚合物,形成類似骨組織的
4、結(jié)構(gòu),可以通過調(diào)整材料的成分比例改變其部分性能,然而這種支架的彈性模量較低,力學(xué)支撐不足,而且對于這種支架材料的成骨能力也未做進一步研究。因此,與殼聚糖組成聚合物的材料,應(yīng)該具有更高的彈性模量,以及更好的成骨能力。鉭具有更高的彈性模量,同時具有較強的成骨能力,而且生物相容性良好,然而,鉭材料由于比重大、過于致密等缺點,無法直接植入人體中。
因此,我們對殼聚糖支架進行改良,制備成含鉭殼聚糖復(fù)合支架。鉭材料較高的彈性模量、較強的成
5、骨能力能否彌補殼聚糖材料在力學(xué)性能與成骨能力方面的不足?復(fù)合支架能否達到修復(fù)骨質(zhì)疏松性骨缺損所需的機械支撐和成骨能力?本研究將對含鉭殼聚糖復(fù)合支架的力學(xué)性能、生物學(xué)特性以及動物體內(nèi)骨質(zhì)疏松性骨缺損的修復(fù)能力進行分析探討。
目的:
1.對含鉭殼聚糖復(fù)合支架的力學(xué)性能進行檢測。
2.對含鉭殼聚糖復(fù)合支架影響骨髓間充質(zhì)干細胞的粘附、增殖及成骨分化的能力進行檢測,以評估支架的生物學(xué)特性。
3.利用骨質(zhì)疏松
6、兔模型檢測含鉭殼聚糖復(fù)合支架修復(fù)動物體內(nèi)骨質(zhì)疏松性骨缺損的能力。
方法:
1.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架的力學(xué)性能,使用ElectroForce3100Test Instrument測出支架的載荷——位移曲線。對曲線初始階段相對平滑的線性部分進行分析,并計算出支架的彈性模量(E)。
2.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架的生物學(xué)特性,將大鼠BMSCs置于含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天更換培
7、養(yǎng)液,匯合后用0.25%胰酶消化,再用含血清的培養(yǎng)基中止消化,并制備細胞懸液。
3.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架對大鼠BMSCs粘附的影響,培養(yǎng)的大鼠BMSCs分別接種至殼聚糖支架和含鉭殼聚糖復(fù)合支架上。在1小時、2小時、4小時、8小時每個時間點,分別使用CCK-8法于450nm波長處測量OD值,間接反映支架對細胞粘附的影響。
4.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架對大鼠BMSCs增殖的影響,將培養(yǎng)的大鼠BMSCs分別接種至殼聚糖
8、支架和含鉭殼聚糖復(fù)合支架上,使用CCK-8法在24小時、48小時、72小時、96小時和120小時每個時間點對450nm波長處的OD值進行測量。
5.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架對大鼠BMSCs成骨分化的影響,培養(yǎng)的大鼠BMSCs分別接種至殼聚糖支架和含鉭殼聚糖復(fù)合支架上,用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在成骨誘導(dǎo)后第7、14天進行ALP染色,第21、28天進行茜素紅染色,以評估細胞的礦化程度。成骨誘導(dǎo)后第7、14、21、28天分別對
9、樣本礦化時所吸收的鈣離子濃度進行定量分析,間接反映支架對成骨分化的影響。成骨誘導(dǎo)第28天后,Real-time PCR測定成骨相關(guān)基因表達,Western blot法測定成骨相關(guān)目標蛋白質(zhì)表達。
6.為研究含鉭殼聚糖復(fù)合支架對骨質(zhì)疏松性骨缺損的修復(fù)能力,將骨質(zhì)疏松兔隨機分為2組,在腰椎椎體制造骨缺損,然后分別將殼聚糖支架和含鉭殼聚糖復(fù)合支架植入骨缺損部位。12周后取出椎體,使用Micro-CT對標本進行掃描,并對支架周圍的骨小
10、梁數(shù)量、骨體積分數(shù)、骨密度、骨小梁厚度進行檢測及統(tǒng)計分析。用1%甲苯胺藍對標本的硬組織切片進行染色后,鏡下觀察,并對骨面積分數(shù)進行檢測及統(tǒng)計分析。
結(jié)果:
1.復(fù)合支架力學(xué)性能測試結(jié)果
復(fù)合支架力學(xué)性能良好。復(fù)合支架的彈性模量為3.07±0.12GPa,殼聚糖支架的彈性模量為2.38±0.69GPa,復(fù)合支架的彈性模量高于殼聚糖支架,兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
2.復(fù)合支架對骨髓間充
11、質(zhì)干細胞粘附的影響
復(fù)合支架對骨髓間充質(zhì)干細胞的粘附具有更好的促進作用。在第1小時、2小時、4小時、8小時每個時間點,細胞在復(fù)合支架表面的粘附能力均高于殼聚糖支架,并且差異逐漸增大。
3.復(fù)合支架對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響
復(fù)合支架對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖具有更好的促進作用。在第24小時、48小時、72小時、96小時、120小時每個時間點,細胞在復(fù)合支架表面的增殖能力均高于殼聚糖支架,并且差異逐漸增大。<
12、br> 4.復(fù)合支架對骨髓間充質(zhì)干細胞分化的影響
復(fù)合支架對骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化具有更好的促進作用。含鉭殼聚糖復(fù)合支架表面細胞的堿性磷酸酶陽性水平、鈣結(jié)節(jié)顆粒數(shù)量明顯高于殼聚糖支架,從更換成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的第7天開始,復(fù)合支架表面細胞的鈣離子吸收濃度均大于殼聚糖支架,并且差異逐漸增大。成骨誘導(dǎo)第28天后,Real-time PCR測定復(fù)合支架表面細胞的成骨相關(guān)基因表達高于殼聚糖支架,Western blot法測定復(fù)合
13、支架表面細胞的成骨相關(guān)目標蛋白質(zhì)表達高于殼聚糖支架3-5倍。
5.復(fù)合支架修復(fù)骨質(zhì)疏松動物模型骨缺損的能力
復(fù)合支架對骨質(zhì)疏松動物模型骨缺損具有更好的修復(fù)作用。Micro-CT顯示復(fù)合支架周圍的骨小梁厚度、骨體積分數(shù)、骨密度、骨小梁數(shù)量均高于殼聚糖支架,硬組織切片可見復(fù)合支架周圍的骨面積比高于殼聚糖支架。
結(jié)論:
我們的研究結(jié)果表明,含鉭殼聚糖復(fù)合支架不但具有良好的力學(xué)性能,而且還能促進支架表面細
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