甲殼廢棄物資源化關(guān)鍵酶開發(fā)及組合應(yīng)用研究.pdf

1、隨著蝦、蟹水產(chǎn)品的大量生產(chǎn)與消費(fèi)，蝦蟹殼廢棄物的生成量也日益增大。目前，水產(chǎn)加工行業(yè)對(duì)蝦蟹殼的回收還停留于粗加工和簡(jiǎn)單利用上。較低的經(jīng)濟(jì)效益直接制約了蝦蟹殼的資源化利用率。蝦蟹殼中含有大量的甲殼素資源，通過深加工獲得甲殼素衍生產(chǎn)品，是蝦蟹殼廢棄物資源化的有效途徑。目前，甲殼素衍生物的工業(yè)化制備，多為化學(xué)處理方法，加工過程消耗大量的酸和堿，造成環(huán)境二次污染，且產(chǎn)品品質(zhì)難以調(diào)控。而生物酶法由于其反應(yīng)條件溫和、污染小、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，受到

2、廣泛的研究關(guān)注。
　　本研究針對(duì)甲殼素衍生物酶法生產(chǎn)中所需的三種關(guān)鍵轉(zhuǎn)化酶即甲殼素酶、殼聚糖酶和甲殼素脫乙酰酶進(jìn)行開發(fā)，構(gòu)建出表達(dá)酶的重組菌株，并研究其酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，甲殼素酶和殼聚糖酶的最適溫度分別為55℃和45℃；兩者的最適pH均為5.0左右；而甲殼素脫乙酰酶最適溫度為40℃，最適pH約為7.0。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究表明：甲殼素酶的米氏常數(shù)Km值為12.26g/L，最大反應(yīng)速率vmax為5.33μmol/（L·h）；殼聚糖

3、酶Km值為6.38 g/L，vmax為7.53μmol/（L·h）；脫乙酰酶Km值為32.71 g/L，vmax為15.55μmol/（L·h）。殼聚糖酶對(duì)底物的親和能力和高于其他兩種酶。
　　研究確定了以“脫鈣—脫蛋白—脫色—羧甲基化”為工藝路線的甲殼前處理工藝。針對(duì)（GlcN）n殼寡糖類甲殼低聚糖，確定以羧甲基甲殼素為底物、酶組合為“甲殼素酶-脫乙酰酶”的最優(yōu)制備方法，產(chǎn)率為8.82％；針對(duì)（GlcNAc）n甲殼寡糖類甲殼低聚

4、糖，確定以甲殼素酶單酶解為制備方法，產(chǎn)率為8.92%；寡糖產(chǎn)物經(jīng)TLC分析，表明酶法制備的兩種甲殼低聚糖產(chǎn)物從二糖到六糖均有分布，其中二糖、三糖相對(duì)較多，六糖相對(duì)較少。
　　對(duì)甲殼素酶的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化：誘導(dǎo)劑IPTG的最佳濃度為0.3 mmol/L；最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（OD600為4.0左右）；最佳誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間分別為25℃和誘導(dǎo)6h。利用發(fā)酵罐進(jìn)行菌株的高密度發(fā)酵培養(yǎng)，最高酶活為90.22 U/L。對(duì)酶液的保藏條