p55PIK通過調(diào)節(jié)Treg在潰瘍性結(jié)腸炎惡性轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性消化道炎性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn’s disease，CD）。IBD的嚴(yán)重并發(fā)癥之一為結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC），世界范圍內(nèi) IBD發(fā)展為CRC的風(fēng)險為5-40/10萬。
　　調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells,Treg），是發(fā)揮負(fù)調(diào)功能

2、的免疫抑制性細(xì)胞，主要分泌IL-10和TGF-β等抑炎因子，可抑制效應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答，參與維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)。腸道免疫穩(wěn)態(tài)被打破所導(dǎo)致的腸道免疫紊亂在IBD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其中Th1，Th2，Th17等各種效應(yīng)性細(xì)胞亞群參與介導(dǎo)炎性紊亂，而Treg作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，可平衡、負(fù)向調(diào)節(jié)上述各種效應(yīng)性T細(xì)胞的炎性反應(yīng)，從而在IBD的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。
　　磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide3-kinases

3、，PI3Ks）是生長因子調(diào)控信號通路中的重要分子，在炎癥、增殖、分化、凋亡、糖代謝等發(fā)面發(fā)揮非常重要的作用。PI3K分為ClassI（IA和IB）、II、III型，其中Class IA型PI3K由催化亞基(p110α/β/δ)和調(diào)節(jié)亞基（p85α/β, p55α/γ, p50α）組成的異二聚體。p55PIK(p55γ)與經(jīng)典的調(diào)節(jié)亞基p85在基因結(jié)構(gòu)上不同之處為其N末端含24個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域（N24），是p55PIK與其他調(diào)節(jié)亞基之

4、間的唯一區(qū)別。本課題組利用分子生物學(xué)技術(shù)合成TAT-N15融合肽(N24中的15個短肽與HIV透膜蛋白重組)，作為p55PIK特異性抑制劑。
　　關(guān)于非經(jīng)典的PI3K調(diào)節(jié)亞基p55γ（即p55PIK）的生物學(xué)作用鮮有報道。本課題組對p55PIK相關(guān)的信號通路及其與腫瘤和炎癥的關(guān)系開展了較深入研究，并取得了如下進(jìn)展：在腫瘤方面，首次證實(shí)p55PIK與p85不同，可通過N24募集其他蛋白分子（如Rb和PCNA），并通過i-SH2結(jié)構(gòu)域

5、結(jié)合的p110催化亞基使Rb和PCNA發(fā)生磷酸化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生；在炎癥方面，首次發(fā)現(xiàn)，在LPS所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，p55PIK通過Akt非依賴途徑，誘導(dǎo)NF-κB信號通路中的p65磷酸化，從而促進(jìn)單核細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子。
　　有報道表明，經(jīng)典的PI3K調(diào)節(jié)亞基p85對Treg分化發(fā)揮負(fù)性調(diào)控，但是p55PIK對Treg的調(diào)節(jié)尚不清楚，未見國內(nèi)外相關(guān)研究的報道。
　　結(jié)合上述前期結(jié)果，我們提出科學(xué)問題：p5

6、5PIK能否通過影響Treg而在慢性結(jié)腸炎惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用？
　　本課題以AOM-DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎癌變模型為研究對象，以p55PIK特異性抑制劑（TAT-N15）為治療工具，以生理鹽水（NS）、對照多肽（CP）為對照，分組如下：NS組（模型組）、CP組（陰性對照組）、TAT-N15組（實(shí)驗組）。模型過程DSS誘導(dǎo)同時每天檢測體重、糞便潛血。在AOM-DSS模型中選取以下時間點(diǎn)：急性炎癥期（Day8）、慢性炎癥恢復(fù)期（D

7、ay37）、結(jié)直腸炎相關(guān)腫瘤期（Day70）分別處死小鼠，檢測結(jié)腸長度和HE染色（病理改變）；在各時間點(diǎn)：取小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及結(jié)腸組織，以ELISA檢測結(jié)腸組織勻漿促炎細(xì)胞因子（TNF-?、IL-1β、IL-6）和抑炎細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β）的變化，以流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟、腸系膜淋巴結(jié)中 Treg（CD25+Foxp3+/CD4+）比例，以免疫組化法檢測結(jié)腸組織中Treg（Foxp3+細(xì)胞）數(shù)量。觀察p55PIK抑制劑可否

8、緩解AOM-DSS模型中的炎癥癥狀和模型末的腫瘤形成以及探討p55PIK對結(jié)腸炎和結(jié)直腸腫瘤作用的可能機(jī)制。
　　在體內(nèi)實(shí)驗基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用體外小鼠Treg細(xì)胞分化實(shí)驗：無菌條件下獲取C57BL/6小鼠的脾臟、腸系膜/腹股溝/腋下等淋巴結(jié)，制備細(xì)胞懸液，磁珠、流式分選CD44lowCD62Lhigh Na?ve T細(xì)胞。在抗CD3和抗CD28共刺激信號活化TCR的同時，加入不同濃度的TAT-N15或CP，再加入TGF-β和IL-

9、2進(jìn)行初始T細(xì)胞的體外分化，72h后收集細(xì)胞，流式檢測 Treg細(xì)胞(CD4+Foxp3+)的比例，觀察p55PIK對Treg分化的影響。結(jié)果如下：
　　一.p55PIK通過調(diào)節(jié)Treg促進(jìn)慢性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展
　　1.AOM-DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎癌變模型的構(gòu)建
　　體重和糞便潛血評分隨著2.5％DSS的誘導(dǎo)而呈現(xiàn)有規(guī)律的波動，符合慢性結(jié)腸炎的臨床改變特征，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步成功構(gòu)建AOM-DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)

10、腸炎癌變模型。
　　2.p55PIK抑制劑（TAT-N15）可緩解AOM-DSS模型中炎癥期的基本炎癥性狀
　　p55PIK特異性抑制劑TAT-N15可緩解AOM-DSS模型中急性炎癥和慢性炎癥期的基本性狀：TAT-N15可緩解小鼠慢性結(jié)腸炎導(dǎo)致的體重減輕（p<0.01或p<0.001），對糞便潛血無影響（p>0.05）。在急性炎癥期（Day8）和慢性炎癥恢復(fù)期（Day37），TAT-N15均可有效緩解DSS誘導(dǎo)所致的結(jié)腸長

11、度縮短（p<0.05）和結(jié)腸炎病理學(xué)變化（p<0.01,p<0.05）。提示p55PIK可能參與促進(jìn)小鼠慢性結(jié)腸炎導(dǎo)致的體重減輕，結(jié)腸長度縮短和結(jié)腸炎病理學(xué)變化，從而促進(jìn)AOM-DSS模型中的急性和慢性炎癥的基本炎癥性狀。
　　3.p55PIK抑制劑（TAT-N15）可抑制小鼠慢性結(jié)腸炎結(jié)腸組織中的促炎細(xì)胞因子表達(dá)
　　在急性炎癥期（Day8），小鼠結(jié)腸勻漿中，TAT-N15組的TNF-?和IL-6水平均低于CP組和NS組（

12、p<0.05），而IL-1??的表達(dá)在三組間無統(tǒng)計學(xué)差異；在慢性炎癥恢復(fù)期（Day37），TAT-N15組的IL-1??和IL-6水平均明顯低于CP組和NS組（p<0.05），而 TNF-?的表達(dá)在三組間無統(tǒng)計學(xué)差異；以上結(jié)果表明：TAT-N15可抑制急性炎癥期（Day8）的促炎細(xì)胞因子TNF-?和IL-6的表達(dá)，抑制慢性炎癥恢復(fù)期（Day37）的IL-1??和IL-6的表達(dá)。提示p55PIK可以促進(jìn) AOM-DSS模型中急性炎癥期促炎

13、細(xì)胞因子（TNF-?和IL-6）、慢性炎癥期促炎細(xì)胞因子（IL-1?和IL-6）的表達(dá)。
　　4.p55PIK抑制劑（TAT-N15）可促進(jìn)小鼠慢性結(jié)腸炎結(jié)腸組織中的抑炎細(xì)胞因子表達(dá)
　　在急性炎癥期（Day8）和慢性炎癥恢復(fù)期（Day37），與CP組和 NS組相比，TAT-N15組的結(jié)腸勻漿中IL-10的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；而TAT-N15組的結(jié)腸勻漿中TGF-β的表達(dá)均顯著高于CP組和NS組（p<0.001）。以上結(jié)

14、果表明：在急性炎癥期（Day8）和慢性炎癥恢復(fù)期（Day37），TAT-N15可促進(jìn)結(jié)腸組織中抑炎細(xì)胞因子TGF-?的表達(dá)。該結(jié)果提示：p55PIK可以抑制急性和慢性炎癥期抑炎細(xì)胞因子TGF-?的表達(dá)。
　　5.p55PIK抑制劑（TAT-N15）可增加小鼠慢性結(jié)腸炎的Treg比例
　　在AOM-DSS模型中的慢性炎癥恢復(fù)期（Day37），與CP組和 NS組相比，TAT-N15可增加脾臟和結(jié)腸組織中的Treg比例（p<0.0

15、5,p<0.01），而在腸系膜淋巴結(jié)中無顯著性差異。TAT-N15對急性炎癥期的Treg比例（脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和結(jié)腸組織中）無影響（p>0.05）。該結(jié)果間接提示：在 AOM-DSS慢性炎癥期中，p55PIK可能發(fā)揮負(fù)調(diào)Treg（脾臟和結(jié)腸組織中）的作用。而p55PIK對急性炎癥期的Treg比例（脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和結(jié)腸組織中）無影響。
　　二.p55PIK通過調(diào)節(jié)Treg促進(jìn)炎癥相關(guān)性結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生
　　1.p55PI

16、K抑制劑（TAT-N15）可降低炎癥相關(guān)性結(jié)直腸腫瘤的數(shù)量
　　在腫瘤期（Day70），檢測各組小鼠的腫瘤數(shù)量，結(jié)果表明：TAT-N15可抑制炎癥相關(guān)性結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生，降低腫瘤個數(shù)（p<0.001）。
　　2.p55PIK抑制劑（TAT-N15）可增加炎癥相關(guān)性結(jié)直腸腫瘤小鼠Treg比例
　　TAT-N15可增加炎癥相關(guān)性結(jié)直腸腫瘤小鼠脾臟（p<0.001）、腸系膜淋巴結(jié)（p<0.01）和結(jié)腸組織 Treg比例（p<

17、0.05），提示在 AOM-DSS模型腫瘤期，p55PIK可能通過負(fù)調(diào)Treg而促進(jìn)炎癥相關(guān)性結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　三.p55PIK在體外負(fù)調(diào)Treg細(xì)胞的分化
　　在小鼠體外T細(xì)胞分化實(shí)驗基礎(chǔ)上，觀察TAT-N15對Treg分化的影響。結(jié)果顯示：TAT-N15可促進(jìn)na?ve T細(xì)胞分化為Treg（p<0.05）。提示p55PIK可能發(fā)揮負(fù)調(diào)Treg細(xì)胞分化的作用。
　　結(jié)論：
　　1.p55PIK特異性

18、抑制劑TAT-N15可緩解AOM-DSS模型中急性和慢性炎癥期的炎性基本性狀，其機(jī)制可能是TAT-N15通過降低急性和慢性炎癥期促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并且通過增加慢性炎癥期中脾臟和結(jié)腸組織中的Treg比例而發(fā)揮作用。
　　2.在AOM-DSS模型腫瘤期，TAT-N15可抑制炎癥相關(guān)性結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其機(jī)制可能是TAT-N15可增加腫瘤期小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和結(jié)腸組織的Treg比例。
　　3.TAT-N

19、15可在體外促進(jìn)小鼠na?ve T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞。
　　上述結(jié)果同時提示：
　　1.p55PIK可能促進(jìn)急性和慢性炎癥促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制抑炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并且在慢性炎癥中負(fù)調(diào)Treg的比例而促進(jìn)AOM-DSS模型中的炎癥期炎性反應(yīng)。
　　2.p55PIK可能通過負(fù)調(diào)Treg而促進(jìn)小鼠AOM-DSS腫瘤期腫瘤的發(fā)生發(fā)展及炎癌惡性轉(zhuǎn)化。
　　3.p55PIK可在體外負(fù)調(diào)Treg細(xì)胞的分化。