基于RNA的第二信使電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建與運(yùn)用.pdf

1、環(huán)鳥苷二磷酸(cyclic diguanylate，c-di-GMP)是在細(xì)菌中普遍存在的第二信使分子，它參與調(diào)節(jié)細(xì)菌內(nèi)一系列復(fù)雜的生理生化過程，包括細(xì)菌通訊，細(xì)胞分化，生物被膜形成，細(xì)胞形態(tài)變化以及致病因子的產(chǎn)生等。環(huán)磷酸腺苷(CyclicadenosineMonosphate，cAMP)是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)第二信使，它通過PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控一系列細(xì)胞內(nèi)生理生化過程。無論是c-di-GMP還是cAMP，均是細(xì)胞內(nèi)重要的信息傳遞分

2、子。細(xì)胞通過調(diào)控第二信使的水平，指導(dǎo)信號(hào)通路工作，維持相對(duì)穩(wěn)態(tài)。電化學(xué)生物傳感器是一類優(yōu)點(diǎn)突出的生物傳感技術(shù)，近年來被廣泛用于小分子物質(zhì)檢測(cè)中，在環(huán)境檢測(cè)，食品檢測(cè)，臨床運(yùn)用等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。相較于傳統(tǒng)檢測(cè)手段，電化學(xué)生物傳感器以其響應(yīng)快速，特異性更高，選擇性更好，操作簡(jiǎn)易，價(jià)格低廉等特點(diǎn)，成為一種具有重大發(fā)展?jié)摿Φ纳锓治黾夹g(shù)。電化學(xué)生物傳感器種類繁多，根據(jù)所修飾生物材料的不同可以分為:酶電極傳感器，微生物電極傳感器，電化學(xué)免疫

3、傳感器，組織與細(xì)胞電極傳感器以及電化學(xué)核酸傳感器。其中電化學(xué)核酸傳感器因?yàn)槠涿舾性怂嵯噍^于微生物，組織，細(xì)胞和蛋白質(zhì)等生物大分子來說，分子量更小，特異性更好，并且易于合成和修飾，所以越來越受到研究者們的青睞，成為底物特異性識(shí)別探針的優(yōu)良選擇。
　　核糖開關(guān)（riboswitch）是一類通過結(jié)合小分子代謝物調(diào)控基因表達(dá)的mRNA元件。它具有和適配體一樣的高度特異性，但又不同于適配體:它是一類天然的核酸分子。本論文通過結(jié)合核糖開關(guān)

4、c-di-GMP-Ⅰ對(duì)c-di-GMP的高效識(shí)別能力和電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)高靈敏的電信號(hào)采集能力，將帶有巰基末端的c-di-GMP特異性核糖開關(guān)，通過Au-S自主裝的方式固定到金電極表面，構(gòu)建了一套無標(biāo)記的c-di-GMP電化學(xué)核酸傳感器。經(jīng)驗(yàn)證，該傳感器無論是靈敏度方面還是在選擇性方面，均達(dá)到了期望的檢測(cè)效果。它對(duì)靶分子c-di-GMP的檢測(cè)下限為50nM，較之前報(bào)道過的最低c-di-GMP檢測(cè)下限320 nM有顯著的下降，實(shí)現(xiàn)了更微量的檢

5、測(cè)。另外，該傳感器還實(shí)現(xiàn)了在預(yù)處理過的生物樣品中的檢測(cè)，這對(duì)實(shí)際運(yùn)用來說具有重要意義。
　　近年來，以RNA適配體（aptamer）作為目標(biāo)分子特異性識(shí)別元件的核酸傳感器，無論是在靈敏度還是選擇性方面都表現(xiàn)出了更優(yōu)異的性能。適配體是利用指數(shù)富集的配體進(jìn)化技術(shù)(SELEX)從特定的寡核苷酸庫中篩選出的，能與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸（DNA或RNA）。我們課題組基于適配體的優(yōu)良特性，構(gòu)建了cAMP適配體電化學(xué)核酸傳感器，該傳感器在P