基于雙發(fā)卡型和Y型結(jié)構(gòu)DNA構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器在Hg2+和ATP分析檢測中的應(yīng)用.pdf

1、快速、廉價、高選擇性和高靈敏度檢測與生命活動相關(guān)的小分子與蛋白質(zhì)，與疾病相關(guān)的特征DNA序列以及重金屬污染物是現(xiàn)代生物化學(xué)研究的重要課題。近年來，隨著科技的不斷發(fā)展，DNA電化學(xué)生物傳感器作為一門新興的、涉及生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、電化學(xué)及信息技術(shù)等領(lǐng)域的交叉學(xué)科，已被廣泛應(yīng)用到基因診斷、環(huán)境監(jiān)測、藥物研究等領(lǐng)域。DNA電化學(xué)生物傳感器是一類以核酸分子作為識別元素，以電極作為信號轉(zhuǎn)換器的生物傳感器。核酸分子探針具有特異性強、結(jié)構(gòu)簡單、靶物質(zhì)分子

2、廣泛及易于大量化合成等優(yōu)點。DNA電化學(xué)生物傳感器結(jié)合了核酸探針的優(yōu)異性能和電化學(xué)檢測方法的高靈敏度特性，在現(xiàn)代生物傳感器研究領(lǐng)域中占主體地位。此外，關(guān)于發(fā)掘核酸修飾電極的新性能、設(shè)計與制備新型核酸探針、開發(fā)新型高效的DNA電化學(xué)傳感器的研究也越來越受到大家的關(guān)注。本論文基于DNA的雙發(fā)卡型和Y型結(jié)構(gòu)，通過結(jié)合比率法和核酸外切酶III輔助的信號循環(huán)放大策略構(gòu)建了四種新型電化學(xué)生物傳感器，實現(xiàn)了對汞離子和ATP的高靈敏高選擇性檢測。主要內(nèi)

3、容如下：
　　1.基于雙標(biāo)記的DNA雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)和插入法構(gòu)建用于靈敏檢測ATP的電化學(xué)生物傳感器
　　本章基于雙標(biāo)記的雙發(fā)卡DNA及插入法構(gòu)建了一種用于檢測ATP的電化學(xué)適配體傳感器。首先將巰基和亞甲基藍（MB）標(biāo)記的適配體探針插入到電極表面修飾了二硫蘇糖醇（DTT）單分子層的金電極上，此時MB標(biāo)記的輔助探針能夠在電極表面與適配體探針進行雜交形成雙發(fā)卡DNA結(jié)構(gòu)。在沒有ATP存在的情況下，這種穩(wěn)定的雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)拉近了MB與電極表

4、面之間的距離，可以檢測到很強的電流信號。當(dāng)有ATP存在時，適配體探針與ATP之間的特異性結(jié)合使得適配體探針末端的MB遠離電極表面，輔助探針離開電極，使檢測到的電流信號明顯降低。該傳感器檢測ATP的線性濃度范圍濃度為5nmol L-1-1μmol L-1，最低檢出限為1.4nmol L-1。
　　2.基于使用插入法和DNA雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)作為信號放大技術(shù)構(gòu)建一種用于靈敏檢測汞離子的可再生電化學(xué)生物傳感器
　　本章研究了一種簡單有效的

5、用于檢測汞離子的電化學(xué)生物傳感器。這種新穎的傳感器采用插入法將巰基標(biāo)記的DNA探針插入到已組裝了一層二硫蘇糖醇（DTT）分子的金電極表面上，提高了DNA探針間的雜交效率。文章中通過比較分析采用單發(fā)卡DNA結(jié)構(gòu)制備的電化學(xué)傳感器與采用雙發(fā)卡DNA結(jié)構(gòu)制備的電化學(xué)傳感器之間阻抗值的變化，發(fā)現(xiàn)雙發(fā)卡DNA結(jié)構(gòu)修飾的電化學(xué)傳感器具有更高的靈敏度，基于這個發(fā)現(xiàn)構(gòu)建了雙發(fā)卡DNA修飾的用于高靈敏檢測汞離子的電化學(xué)生物傳感器。該傳感器檢測汞離子的線性

6、濃度范圍為0.1nmol L L-1-5μmol L-1，最低檢出限為28pmol L-1.此外，該傳感器不僅具有良好的選擇性，而且具有良好的可再生性。
　　3.基于DNA在Y型與發(fā)卡型結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)換制備的用于檢測Hg2+可再生比率式生物傳感器
　　本章結(jié)合比率法和Y型結(jié)構(gòu)DNA構(gòu)建了一種簡單的，可靠的檢測Hg2+的電化學(xué)生物傳感器。在該工作中，首先將分別標(biāo)記了亞甲基藍和二茂鐵標(biāo)記的兩條DNA探針通過簡單的退火處理讓其形成Y

7、型結(jié)構(gòu)的DNA。然后將制備好的Y型DNA利用Au-S鍵自組裝到電極表面，此時通過電化學(xué)方法測量可以觀察到一個很明顯的二茂鐵的電流信號和一個較為微弱的亞甲基藍的電流信號。最后將該傳感器與Hg2+后，由于T堿基與Hg2+間的特異性作用使得Y型DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)卡型結(jié)構(gòu)。在這個過程中，亞甲基藍逐漸靠近電極表面，二茂鐵隨著DNA探針離開電極表面。隨著Hg2+濃度的增加，所檢測到的亞甲基藍的電流信號逐漸增大，而二茂鐵的電流信號逐漸減小。利用這種信

8、號比率式電化學(xué)生物傳感器檢測Hg2+的線性范圍為1nmol L-1-5μmol L-1，檢測限為0.094nmol L-1。
　　4.基于核酸外切酶III輔助放大信號構(gòu)建靈敏選擇性檢測Hg2+的可再生比率生物傳感器
　　本章研制一種基于核酸外切酶III（Exo III）輔助放大信號的可再生比率式生物傳感器，并成功應(yīng)用于Hg2+的高靈敏、高選擇性檢測。該傳感器首先將分別標(biāo)記了亞甲基藍和二茂鐵的兩條DNA探針在溶液中雜交形成Y型

9、DNA結(jié)構(gòu)，然后將其自組裝到電極表面，此時可以檢測到一個微弱的亞甲基藍的電流信號和一個較為明顯的二茂鐵的電流信號。在有Hg2+存在情況下，二茂鐵標(biāo)記的探針（Fc-probe）與溶液中的輔助鏈在Hg2+作用下形成雙螺旋結(jié)構(gòu)后離開電極表面，使Y型DNA轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓡我坏膩喖谆{標(biāo)的探針（MB-probe）形成的發(fā)卡型結(jié)構(gòu)。此時，由于Exo III能選擇性剪切雙鏈結(jié)構(gòu)中的Fc-probe，釋放出的Hg2+和輔助探針能繼續(xù)與電極上的Y型DNA作用，