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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究旨在應(yīng)用基因過(guò)表達(dá)技術(shù)、心血管功能學(xué)、western blot、核團(tuán)顯微注射和免疫組化等方法探討內(nèi)源性H2S在RVLM對(duì)心血管調(diào)節(jié)功能及其作用機(jī)制。研究分為三部分:
第一部分 RVLM區(qū)過(guò)表達(dá)CBS基因?qū)BS蛋白和H2S水平的影響
目的:H2S具有與NO和CO相似的生物學(xué)特性,被認(rèn)為是第三種氣體信號(hào)分子。由于H2S本身存在半衰期短、代謝快的特點(diǎn),給長(zhǎng)期給予H2S制造了瓶頸。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因治療作為有別
2、于傳統(tǒng)藥物治療的新治療手段顯示出巨大的潛力,重組腺病毒載體攜帶目的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)日益成熟。RVLM中轉(zhuǎn)染攜帶CBS基因的腺病毒,能夠長(zhǎng)期生成H2S,為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)探討H2S的基因治療奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法:將CBS cDNA(GenBank: M88344.1)連接到質(zhì)粒PMD19-Simple-T中,并將連接好的質(zhì)粒PMD19-Simple-T-CBS包裝到腺病毒載體上。將AdCBS轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中,測(cè)定最佳MOI
3、值,同時(shí)測(cè)定了CBS和H2S的含量。顯微注射到大鼠的RVLM區(qū),使CBS蛋白在RVLM區(qū)過(guò)表達(dá)。觀察CBS的表達(dá)周期,測(cè)定了RVLM區(qū)CBS蛋白表達(dá)情況和H2S的含量。
結(jié)果:通過(guò)Western blot、PCR及基因測(cè)序等方法證明已經(jīng)將CBS的cDNA成功包裝到PMD19-Simple-T質(zhì)粒中。隨后將PMD19-Simple-T-CBS質(zhì)粒包裝到腺病毒載體中(adenoviral vectors carrying CBS
4、gene,AdCBS)。AdEGFP(adenoviral vectors carrying enhanced green fluorescent protein)組為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染前后每隔一天,取RVLM區(qū),觀察熒光,CBS蛋白和H2S的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染AdCBS后的第7天,RVLM區(qū)熒光最強(qiáng),CBS蛋白和H2S水平最高,證明CBS成功轉(zhuǎn)染到RVLM區(qū)了。
結(jié)論:將CBS的cDNA構(gòu)建到了PMD19-Simple-T
5、質(zhì)粒中,隨后包裝到腺病毒載體中,并成功將AdCBS轉(zhuǎn)染到RVLM區(qū),CBS蛋白和H2S含量明顯增加。
第二部分 RVLM過(guò)表達(dá)CBS對(duì)正常大鼠H2S介導(dǎo)的交感神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)控作用
目的:H2S是一種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子,在外周具有舒張血管抵抗高血壓等保護(hù)作用,但其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)心血管的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。H2S曾經(jīng)被報(bào)道在RVLM區(qū)具有交感抑制的效果。當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)判定長(zhǎng)期在RVLM給予H2S對(duì)血壓和交感神經(jīng)活動(dòng)的影響。
6、
方法:在本實(shí)驗(yàn)中,血壓正常大鼠RVLM區(qū)AdCBS轉(zhuǎn)染7天后,進(jìn)行急性實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果:1.RVLM區(qū)注射AdCBS7天后,檢測(cè)RVLM區(qū)CBS表達(dá)和H2S的含量?;蜣D(zhuǎn)染7天后,與AdEGFP相比,AdCBS組CBS蛋白增加了83%。此外AdCBS組H2S水平也顯著高于AdEGFP組。
2.基因轉(zhuǎn)染前后,測(cè)定了各組大鼠清醒狀態(tài)的SBP和HR,AdCBS組與AdEGFP組組間無(wú)差異。
3.顯微注射實(shí)
7、驗(yàn)前對(duì)RVLM進(jìn)行功能定位,單側(cè)RVLM微量注射L-谷氨酸后,觀察到血壓升高20~30mmHg,提示注射部位確實(shí)為RVLM。AdCBS組RVLM區(qū)顯微注射HA后,RSNA,MAP和HR均升高,但AdCBS組的升高幅度大于AdEGFP組。AdEGFP與未處理組,RSNA,MAP,HR升高的幅度組間無(wú)差異。
4.在基因轉(zhuǎn)染后的第七天,我們檢測(cè)了Kir6.1,Kir6.2,SUR1和SUR2蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示在AdCBS組Kir6.
8、1和SUR2蛋白表達(dá)升高,而SUR1和Kir6.2并沒(méi)有發(fā)生顯著改變。
結(jié)論:盡管RVLM過(guò)表達(dá)CBS并沒(méi)有影響SBP和HR,但是和AdEGFP組相比,在AdCBS組RVLM區(qū)顯微注射CBS抑制劑所誘發(fā)的RSNA,MAP和HR的增加幅度明顯增強(qiáng)。預(yù)先注射KATP通道激動(dòng)劑,HA的效果被取消;注射KAT,通道阻斷劑,AdCBS組RSNA,MAP和HR均升高,而AdEGFP組各變量沒(méi)有顯著改變,并且RVLM區(qū)增加了Kir6.1和S
9、UR2蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示RVLM區(qū)增加的KAT,通道可能為AdCBS組RVLM區(qū)顯微注射CBS抑制劑所導(dǎo)致的增強(qiáng)的升壓反應(yīng)負(fù)責(zé)。這些發(fā)現(xiàn)提示CBS/H2S系統(tǒng)可能是某些交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)疾病心血管基因治療的重要靶點(diǎn)。
第三部分 RVLM區(qū)CBS/H2S系統(tǒng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心血管活動(dòng)的調(diào)控作用
目的:SHR交感神經(jīng)過(guò)度激活。RVLM區(qū)對(duì)心血管的調(diào)控有重要的作用。在我們的實(shí)驗(yàn)中,和WKY大鼠相比,SHR的RVLM區(qū)的
10、CBS蛋白和H2S含量均降低。這些研究結(jié)果提示RVLM區(qū)CBS/H2S系統(tǒng)可能與交感神經(jīng)過(guò)度激活有關(guān)。因此,我們推測(cè)CBS/H2S系統(tǒng)可能在SHR的交感神經(jīng)過(guò)度激活和血壓升高中起重要作用。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明H2S和NO相互作用調(diào)節(jié)著心血管的功能。另外,SHR的RVLM區(qū)的NO介導(dǎo)交感抑制效果明顯減弱,因此我們猜測(cè),H2S在SHR RVLM區(qū)對(duì)交感神經(jīng)的調(diào)控作用可能是通過(guò)CBS/H2S系統(tǒng)和NOS/NO系統(tǒng)相互作用實(shí)現(xiàn)的。所以,我們通過(guò)在
11、RVLM區(qū)過(guò)表達(dá)CBS來(lái)證明這個(gè)假說(shuō)。該研究有望闡明SHR RVLM中的CBS/H2S系統(tǒng)在交感神經(jīng)激活機(jī)制中的作用及其關(guān)鍵靶點(diǎn),為防治原發(fā)性高血壓奠定理論基礎(chǔ),提供新思路。
方法:利用基因過(guò)表達(dá)的方法,將AdCBS轉(zhuǎn)染到RVLM區(qū),觀察RVLM增加的CBS/H2S系統(tǒng)對(duì)SHR清醒狀態(tài)下SBP, HR和RSNA的影響;應(yīng)用核團(tuán)顯微注射的方法,RVLM區(qū)顯微注射L-NMMA,觀察SHR RVLM區(qū)CBS/H2S系統(tǒng)對(duì)NOS/NO
12、系統(tǒng)的影響;Western blot等方法檢測(cè)RVLM區(qū)NOS/NO系統(tǒng)的的表達(dá)情況,并探討與RVLM區(qū)CBS/H2S系統(tǒng)與NOS/NO系統(tǒng)之間的相互關(guān)系。
結(jié)果:1.CBS基因轉(zhuǎn)染7天后,RVLM區(qū)CBS表達(dá)增加到最大值。另外,在基因轉(zhuǎn)染的第七天,Western blot結(jié)果顯示,SHR+AdEGFP組RVLM區(qū)CBS蛋白表達(dá)明顯低于WKY+AdEGFP組。AdCBS組RVLM區(qū)CBS蛋白的表達(dá)明顯高于AdEGFP組和未處理
13、組。然而,在SHR+AdCBS組和WKY+AdCBS組之間,CBS蛋白表達(dá)沒(méi)有差異。我們?cè)诨蜻^(guò)表達(dá)后的第7天也檢測(cè)了H2S的含量。AdCBS組的H2S的含量明顯高于AdEGFP組。SHR+AdEGFP組H2S的含量明顯低于WKY+AdEGFP組。WKY+AdCBS和SHR+AdCBS組H2S含量組間無(wú)差異。
2.在清醒狀態(tài)下,我們測(cè)定了各組大鼠的SBP和HR。在RVLM區(qū)CBS基因轉(zhuǎn)染后的第5天到第10天,SHR的SBP和H
14、R明顯升高,但是WKY組沒(méi)有改變。AdEGFP組SBP和HR和未處理組組間無(wú)差異。
在基因轉(zhuǎn)染前,SHR24小時(shí)尿中的去甲腎上腺素水平明顯高于WKY組。在基因轉(zhuǎn)染后的第7天,SHR+AdCBS組的尿中去甲腎上腺素水平明顯高于SHR+AdEGFP組。然而,在基因轉(zhuǎn)染前后,WKY+AdEGFP組和WKY+AdCBS組尿中的去甲腎上腺素水平?jīng)]有差異。
3.為了驗(yàn)證過(guò)表達(dá)CBS是否上調(diào)了NOS/NO系統(tǒng),我們檢測(cè)了RVLM區(qū)
15、NOS蛋白和NOx的水平。SHR和WKY組RVLM區(qū)nNOS蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著差異。然而,SHR+AdCBS組RVLM區(qū)nNOS蛋白表達(dá)量明顯降低,和SHR+AdEGFP相比。WKY組組間無(wú)差異。ENOS和iNOS各組組間無(wú)差異。在SHR NOx水平明顯低于WKY組,并且CBS基因轉(zhuǎn)染后,NOx水平進(jìn)一步下降,但是NOx在WKY組組間沒(méi)有發(fā)生變化。
4.和WKY+AdEGFP相比,SHR+AdEGFP的GABA的水平明顯降低?;?/p>
16、因轉(zhuǎn)染后,SHR+AdCBS組GABA的水平進(jìn)一步降低,WKY+AdEGFP組和WKY+AdCBS組組間無(wú)差異。
5.在基因轉(zhuǎn)染后的第7天,各組RVLM區(qū)顯微注射L-NMMA導(dǎo)致了RSNA,動(dòng)脈血壓(arterial blood pressure,ABP)和HR的升高。在SHR+AdEGFP組RVLM區(qū)顯微注射L-NMMA誘發(fā)的升壓反應(yīng)明顯鈍化,和WKY+AdEGFP組相比。另外,SHR+AdCBS組L-NMMA所誘發(fā)的升壓反
17、應(yīng)的幅度明顯低于SHR+AdEGFP組,但是WKY組組間無(wú)差異。RVLM區(qū)顯微注射人工腦脊液(100 nL),RSNA,ABP和HR沒(méi)有發(fā)生改變。
結(jié)論:當(dāng)前的研究表明SHR的RVLM區(qū)過(guò)表達(dá)CBS增加了SBP,HR和尿中的去甲腎上腺素水平。這些效果可能被NOS/NO系統(tǒng)介導(dǎo)。這些結(jié)果提示CBS/H2S系統(tǒng)和NOS/NO系統(tǒng)之間的相互作用影響了過(guò)度興奮的交感神經(jīng)活動(dòng),并且SHR RVLM區(qū)減少的CBS蛋白可能是一個(gè)重要的補(bǔ)償機(jī)
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