基于天蠶素的新型、高效抗菌肽的設(shè)計(jì)與篩選及其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的保護(hù)作用.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)是天然免疫在生物體內(nèi)組成性或誘導(dǎo)性表達(dá)的一些內(nèi)源肽，構(gòu)成了機(jī)體防御病原體快速而高效的手段。AMPs抗菌活性高，抗菌譜廣，種類多，靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變，具有免疫調(diào)節(jié)功能，應(yīng)用十分廣泛。它可以替代抗生素，可以作為飼料添加劑，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群的平衡，改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)。天蠶素（Cecropins）是世界上發(fā)現(xiàn)最早、研究最徹底、效果明顯的一類抗菌肽。鯊魚是豐富的海洋資源，其肝臟占

2、自身內(nèi)臟的75％，鯊肝活性肽(Active peptide from shark liver，APSL)具有免疫調(diào)節(jié)功能。結(jié)直腸癌是全球第三大惡性腫瘤，是癌癥死亡的重要原因，炎性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)患者的直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于普通人群，因此炎性腸病的治療非常重要。APSL基因和Cecropins基因融合表達(dá)的重組蛋白有可能是具有更高活性的抗菌肽，能成為新的飼料添加劑，可以預(yù)防治療腸炎，成為治

3、療炎性腸病的藥物。本課題的目的就是利用Cecropins基因和APSL基因融合表達(dá)篩選得到新型、高效的AMPs，并研究其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)模型小鼠的保護(hù)作用同時(shí)初步研究其作用機(jī)制。
　　本課題對(duì)鯊魚再生肝臟cDNA文庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，成功篩選到一系列大小為105bp、編碼多肽等電點(diǎn)大于10.5、可能具有潛在功能的基因序列。通過重疊PCR成功構(gòu)建了16個(gè)pET-dute-His-sumo

4、-AP SL-Cecropins和10個(gè)pET-dute-His-sumo-Cecropins-APSL重組質(zhì)粒。將這26個(gè)重組質(zhì)粒原核表達(dá)純化，相同濃度時(shí)比較重組APSL蛋白抗菌活性，發(fā)現(xiàn)了抗菌活性較高的重組APSL863s蛋白;相同濃度時(shí)比較重組APSL863s蛋白、Cecropins蛋白和APSL863蛋白的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)重組APSL863s蛋白抗菌活性較高，成功地篩選到一個(gè)抗菌活性較高的AMPs。
　　本課題對(duì)重組APSL

5、863s蛋白對(duì)UC模型小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制開展了研究。用葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)構(gòu)建UC模型，采取預(yù)防性治療給藥方式，分別給予各實(shí)驗(yàn)組小鼠重組APSL863s蛋白、Cecropins蛋白和APSL863蛋白。觀察各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重、腹瀉、便血和結(jié)腸的變化。與DSS組相比，重組APSL863s蛋白和Cecropins蛋白均能顯著減輕小鼠結(jié)腸炎的疾病癥狀(P＜0.05)，但重組APSL863s

6、蛋白的緩解效果較好;對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色，對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜和杯狀細(xì)胞完整，重組APSL863s蛋白和Cecropins蛋白均能改善腸炎小鼠結(jié)腸組織的受損情況，但重組APSL863s蛋白的緩解效果較好;對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠的結(jié)腸組織提取RNA進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)分析其炎癥因子表達(dá)量的變化，重組APSL863s蛋白可以顯著降低IFNγ、IL1β、IL17α炎癥因子的表達(dá)量(P＜0.05);對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠腸道內(nèi)容物（小鼠糞

7、便）進(jìn)行16s rDNA基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes和Prevotellaceae UCG-001菌屬、Turicibacter菌屬與DSS誘導(dǎo)型小鼠腸炎的致病息息相關(guān)，重組APSL863s蛋白可以提高腸道菌群的豐度和多樣性，改善UC小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡。
　　本研究成功篩選到基于Cecropins的新型、高效AMPs—重組APSL863s，它對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模