sn-1,3專一性脂肪酶的篩選、重組表達(dá)和分子改造研究.pdf

1、酶法合成母乳脂肪替代品是近年來(lái)的功能性油脂方面的研究熱點(diǎn)，而sn-1，3專一性脂肪酶是其中的關(guān)鍵原料之一。然而，市場(chǎng)上sn-1，3專一性脂肪酶制劑非常有限且價(jià)格昂貴，需要在sn-1，3專一性脂肪酶的生產(chǎn)技術(shù)上獲得突破，以獲得低成本、高活力的脂肪酶制劑。本研究以提高sn-1，3專一性脂肪酶產(chǎn)量及降低其生產(chǎn)成本為目標(biāo)，主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　1.從中國(guó)傳統(tǒng)食品蒸餃的蒸籠屜中篩選產(chǎn)脂肪酶微生物，分離篩選21株產(chǎn)脂肪酶微生物。進(jìn)一步篩選到

2、1株脂肪酶高產(chǎn)菌株出芽短梗霉(Aureobasidium sp.)S4，通過(guò)響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，在該條件下脂肪酶酶活達(dá)到了31.75U/mL，較優(yōu)化前提高到3.41倍。并對(duì)該脂肪酶sn-1，3專一性進(jìn)行了鑒定。
　　2.通過(guò)密碼子優(yōu)化改造了編碼sn-1，3位置專一性TLL基因和RML基因，并將其克隆轉(zhuǎn)化到Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組表達(dá)。TLL重組菌株在搖瓶中發(fā)酵168 h得到的發(fā)酵液上清p

3、NPP水解酶活為312.72 U/mL，比原始TLL基因重組菌酶活提高了74.29％。然而，RML重組畢赤酵母菌平均酶活僅為3.77 U/mL。
　　3.含前導(dǎo)肽脂肪酶pTL的對(duì)應(yīng)GS-p TL菌株的胞外脂肪酶表達(dá)水平(434.32 U/mL)顯著高于不含前導(dǎo)肽的GS-TL和前導(dǎo)肽帶Kex2位點(diǎn)的GS-kTL的對(duì)應(yīng)值，表明TLL脂肪酶的5氨基酸前導(dǎo)肽能提高自身的表達(dá)水平。另外，提高前導(dǎo)肽疏水性的分子改造，突變體的重組菌株酶活(48

4、3.29 U/mL)較GS-pTL提高11.27％，表明pTL前導(dǎo)肽的疏水性有利于脂肪酶TLL的重組表達(dá)水平。RML脂肪酶潛在的Kex2酶切位點(diǎn)改造實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該位點(diǎn)并不影響RML的重組表達(dá)。
　　4.對(duì)多種sn-1，3專一性脂肪酶同工酶共表達(dá)方式進(jìn)行比較，從整體酶活上比較，Kex2介導(dǎo)的共表達(dá)結(jié)果最佳。Kex2介導(dǎo)的RML和kTL共表達(dá)脂肪酶菌株（GS--RMk-kTL）平均胞外為酶活306.91 U/mL，略大于單獨(dú)表達(dá)RML

5、和kTL脂肪酶酶活（分別為2.89和300.59U/mL）及二者之和(303.48 U/mL)，表明脂肪酶共表達(dá)同工酶可一定程度提高酶的表達(dá)水平。但由于RML酶活水平較低，限制了共表達(dá)對(duì)酶整體表達(dá)水平的提高效果。融合蛋白脂肪酶同工酶成功得到表達(dá)，但是由于結(jié)構(gòu)受到影響因而酶活較低，顯著低于單獨(dú)的TLL的對(duì)應(yīng)酶活。2A斷裂肽能夠在酵母中介導(dǎo)多蛋白共表達(dá)以及分泌，但是嚴(yán)重影響2A下游蛋白TL的表達(dá)量。
　　5.在搖瓶水平對(duì)對(duì)畢赤酵母TL