γ-氨基丁酸對梨果實(shí)青霉病抗性的誘導(dǎo)作用及相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、病原菌侵染是導(dǎo)致果實(shí)采后損失的主要因素之一。在當(dāng)前國內(nèi)外廣泛探索的非殺菌劑型病害控制方法中，誘導(dǎo)抗性技術(shù)和理論是研究的熱點(diǎn)。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA）作為一種新型食品功能因子，已在食品工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用。近年來的研究表明，GABA作為一種重要的植物代謝產(chǎn)物，在果實(shí)采后逆境條件下的代謝調(diào)控、抗性應(yīng)激反應(yīng)和環(huán)境脅迫應(yīng)答中可能均起到了關(guān)鍵作用。但是關(guān)于GABA對果實(shí)抗病性影響的研究卻尚為空白。本課題重點(diǎn)

2、分析了GABA對梨果實(shí)青霉病抗性的誘導(dǎo)作用及其主要影響因素;并通過分析GABA對病原菌、對梨果實(shí)抗性相關(guān)的生理生化反應(yīng)和抗性相關(guān)的基因表達(dá)、對處理后果實(shí)的超微結(jié)構(gòu)、品質(zhì)和對梨果實(shí)抗性物質(zhì)代謝、GABA代謝途徑的影響等，探討了GABA誘導(dǎo)梨果實(shí)抗性的生物學(xué)機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.GABA對梨果實(shí)抗性誘導(dǎo)的作用規(guī)律
　　1～1000μg/mlGABA在梨果實(shí)傷口處對青霉病沒有直接抑制作用，但能誘導(dǎo)梨果實(shí)對擴(kuò)展青霉（Pe

3、nicillium expansum）的抗性，其效力與GABA的濃度、GABA的處理時間以及病原菌濃度等因素密切相關(guān)。在常溫條件下100μg/mlGABA預(yù)先處理傷口組織24h后可以顯著降低104spores/mlP.expansum引起的梨果實(shí)青霉病，發(fā)病率相比對照組降低了54.5％;而在低溫貯藏的早期（接入病原菌后的第16天），可以完全抑制病害的發(fā)生;整果處理也顯示了較好的控制效力，病害發(fā)生率降低了22.2％。但GABA的誘導(dǎo)抗性效

4、能隨病原菌濃度的升高而下降。
　　此外，GABA處理后的梨果實(shí)在一個月的貯藏期的品質(zhì)指標(biāo)與對照組相比沒有發(fā)生顯著性變化，說明GABA處理并沒有對梨果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響。
　　2.GABA對病原菌和梨果實(shí)的作用機(jī)理
　　2.1、GABA對擴(kuò)展青霉在體外和體內(nèi)孢子萌發(fā)的影響
　　1～1000μg/mlGABA在PDA固體培養(yǎng)基和PDB液體培養(yǎng)基中均不能顯著抑制P.expansum的生長;而在果實(shí)體內(nèi)，當(dāng)100μg/m

5、lGABA處理與病原菌接種時間間隔提高到24h后，可以顯著而強(qiáng)烈的抑制組織傷口處P.expansum的孢子萌發(fā)。這些結(jié)果暗示:GABA能夠降低梨果實(shí)青霉病的機(jī)制可能主要與其能誘導(dǎo)梨果實(shí)的抗性有關(guān)。
　　2.2、GABA對梨果實(shí)組織超微結(jié)構(gòu)的影響
　　采用SEM和TEM電鏡觀察GABA處理對梨果實(shí)傷口組織超微結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)GABA誘導(dǎo)處理后再接入P.expansum的果實(shí)組織細(xì)胞壁較厚，組織形態(tài)和細(xì)胞器保存基本完好，而對照組

6、內(nèi)含物由于大量滲出而減少，且已成碎片狀，部分果實(shí)組織和細(xì)胞出現(xiàn)崩潰和死亡的現(xiàn)象。以上結(jié)果說明GABA能在細(xì)胞組織水平上增強(qiáng)梨果實(shí)對病原菌的抗性。
　　2.3、GABA對梨果實(shí)抗性相關(guān)生理指標(biāo)的影響
　　通過測定8個與果實(shí)防御系統(tǒng)相關(guān)的生理生化指標(biāo)并利用激光共聚焦顯微鏡觀察ROS在組織細(xì)胞爆發(fā)情況表明，GABA誘導(dǎo)處理后再接入P.expansum果實(shí)組織的多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)

7、、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性相比GABA或P.expansum單獨(dú)處理組均呈現(xiàn)顯著而快速提高的趨勢，而細(xì)胞過量的活性氧(ROS)被有效清除，丙二醛(MDA)含量降低，同時GABA處理還誘導(dǎo)了與病原菌直接作用的幾丁質(zhì)酶(CHI)和β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性的顯著增強(qiáng)。以上結(jié)果表明，GABA處理能激發(fā)梨果實(shí)抗性相關(guān)防御酶系和病程相關(guān)酶活性，并且可能存在Priming機(jī)制。
　　2.4、GABA對梨果實(shí)抗性相

8、關(guān)基因表達(dá)情況的影響
　　利用RT-PCR對梨果實(shí)的PpPPO，PpPOD家族基因、PpPAL、PpCHI家族基因和PpGLU進(jìn)行擴(kuò)增后，均得到預(yù)期大小的單一目的片段。GABA和P.expansum處理后PpPOD3表達(dá)量下調(diào)，PpPOD4、PpCHI2和PpCHI3表達(dá)量沒有顯著變化。家族基因基因結(jié)構(gòu)上的差異最終導(dǎo)致功能上的不同，由此推測PpPOD3、PpPOD4、PpCHI2、PpCHI3可能不參與果實(shí)抗性防御反應(yīng)中POD、C

9、HI酶活性的調(diào)控，因此選擇PpPOD1和PpCHI4為果實(shí)防御系統(tǒng)的抗性調(diào)控目的基因，利用qPCR對其進(jìn)行定量測定。
　　qPCR結(jié)果證明GABA+P.expansum處理顯著誘導(dǎo)梨果實(shí)的PpPPO、PpPOD1、PpPAL、PpCHI4以及PpGLU基因表達(dá)，并展現(xiàn)出更強(qiáng)更快的激發(fā)效果，明顯快于和高于P.expansum單獨(dú)處理的組織，而GABA單獨(dú)處理后防御基因表達(dá)沒有發(fā)生上調(diào)，這在分子水平上進(jìn)一步解釋了GABA能通過調(diào)控梨果

10、實(shí)抗性基因表達(dá)而誘導(dǎo)果實(shí)抗性和可能存在Priming機(jī)制。
　　2.5、GABA對梨果實(shí)體內(nèi)抗性物質(zhì)代謝和GABA支路代謝的影響
　　利用GC-MS檢測GABA、P.expansum單獨(dú)或聯(lián)合處理梨果實(shí)傷口后的物質(zhì)代謝，結(jié)果表明在GABA與P.expansum聯(lián)合處理的果實(shí)組織中，肉桂酸和香豆素含量均顯著高于對照組、GABA、或P.expansum單獨(dú)處理組的含量。這與通過生理生化分析和基因表達(dá)分析得到的GABA與P.exp

11、ansum聯(lián)合處理能顯著誘導(dǎo)果實(shí)組織PpPAL基因表達(dá)，調(diào)控PAL活性升高的結(jié)果一致。因此PAL代謝可能與GABA誘導(dǎo)梨果實(shí)抗性的機(jī)理密切相關(guān)。
　　此外，在P.expansum的生物脅迫下，GABA處理還顯著激發(fā)了GABA的代謝途徑:在GABA與P.expansum聯(lián)合處理的果實(shí)中琥珀酸、谷氨酸鹽和腐胺含量均顯著高于對照組、GABA或P.expansum單獨(dú)處理組，并發(fā)現(xiàn)延胡索酸生成，而在其他三種處理后的果實(shí)中沒有檢測到;同時也