基于夾心免疫法的大腸桿菌電化學(xué)傳感器研究.pdf

1、微生物污染引起的食源性疾病已成為世界公共健康的一個(gè)主要問(wèn)題。據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心估計(jì)，在美國(guó)，每年有7600萬(wàn)人感染食源性疾病。在所有的病原體微生物中，大腸桿菌是最危險(xiǎn)的病原體微生物之一，它可能會(huì)導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎癥如出血性腹瀉、溶血性尿毒綜合征和血栓性血小板減少性紫癜的發(fā)生。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速且成本低的方法用于高靈敏高特異性的檢測(cè)大腸桿菌。
　　本研究開(kāi)發(fā)了三種類型的生物傳感器用于大腸桿菌的高靈敏高選擇性檢測(cè)，傳感器

2、分別基于的放大方式是復(fù)合材料、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)和銀納米(AgNCs)線。這些傳感器都表現(xiàn)出較低的檢出限和較寬的線性范圍，他們也表現(xiàn)出其他優(yōu)點(diǎn)，如選擇性高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性好。此外，這些生物傳感器已成功地應(yīng)用于大腸桿菌的實(shí)際樣品的定量檢測(cè)。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　構(gòu)建了一種基于免疫傳感技術(shù)的高靈敏高選擇性的檢測(cè)大腸桿菌O157:H7的新型電化學(xué)傳感器，該電化學(xué)傳感器將捕獲抗體修飾于SG-PEDOT-AuNPs復(fù)合物修飾的玻碳電極上

3、，在目標(biāo)物即大腸桿菌O157:H7的存在下，可通過(guò)特異性識(shí)別將HRP標(biāo)記的抗體捕獲于電極表面形成一個(gè)夾心型的結(jié)構(gòu)，最后HRP還原電解液中的H2O2產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中，本研究利用了磺化石墨烯和納米金的特有性能，不僅能促進(jìn)電極表面的電子傳遞還能作為一個(gè)能結(jié)合大量抗體的支撐材料，這些都大大提高了傳感器結(jié)合抗體的效率并提高了傳感器的靈敏度。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示該傳感器的檢測(cè)范圍是7.8×10-7.8×106 cf

4、u mL-1，檢出限是3.4×10 cfu mL-1。另外，該傳感器成功應(yīng)用于實(shí)際樣品（礦泉水和牛奶）的檢測(cè)。
　　在該工作中，基于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)耦合過(guò)氧化氫模擬DNA酶放大技術(shù)，本研究構(gòu)建了一個(gè)簡(jiǎn)單無(wú)標(biāo)記、成本低的電化學(xué)生物傳感器用于高靈敏和高選擇性的檢測(cè)大腸桿菌。適配體-引物探針(APP)由大腸桿菌適配體和引物序列組成，其中引物與環(huán)狀探針部分互補(bǔ)，環(huán)狀探針包括兩個(gè)G-四聯(lián)體的互補(bǔ)序列，APP用于識(shí)別目標(biāo)和引發(fā)RCA擴(kuò)增延伸

5、?；赗CA耦合酶的擴(kuò)增策略，目標(biāo)物大腸桿菌引發(fā)形成無(wú)數(shù)的G-四聯(lián)體的重復(fù)序列，它在血紅素和鉀離子的存在下折疊成G-四聯(lián)體/血紅素復(fù)合物，從而對(duì)H2O2產(chǎn)生極強(qiáng)的催化活性并產(chǎn)生顯著的電化學(xué)信號(hào)。據(jù)我們所知，這項(xiàng)工作是第一次基于RCA耦合過(guò)氧化氫模擬DNA酶放大技術(shù)用于電化學(xué)分析檢測(cè)致病菌。在最佳條件下，所提出的生物傳感器具有超高的檢測(cè)范圍跨越5個(gè)數(shù)量級(jí)和極低的檢測(cè)限8 cfu mL-1。此外，本研究的生物傳感器也顯示對(duì)大腸桿菌具有高選擇

6、性，并具有快速、成本低、無(wú)需電化學(xué)標(biāo)記步驟，簡(jiǎn)化操作并避免試劑不穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。因此，基于滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)耦合過(guò)氧化氫模擬DNA酶放大技術(shù)用于檢測(cè)大腸桿菌的電化學(xué)方法很有潛力用于實(shí)際中相關(guān)食品安全分析和臨床診斷。
　　在該項(xiàng)工作中，一個(gè)基于銀納米簇(AgNCs)納米線的簡(jiǎn)單，無(wú)標(biāo)記，低成本電化學(xué)生物傳感器被開(kāi)發(fā)用于高靈敏度和高擇性的檢測(cè)大腸桿菌。為了制備AgNCs納米線，本研究利用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)合成重復(fù)DNA序列用于AgNCs的

7、組裝。RCA反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)成千上萬(wàn)倍的信號(hào)放大。功能寡核苷酸探針(FOP)，含有合成AgNCs的模板序列和可以和RCA產(chǎn)物特異性結(jié)合的序列，AgNCs作為一種金屬模擬酶，有較強(qiáng)的催化H2O2還原的功能。結(jié)合RCA擴(kuò)增策略，AgNCs結(jié)合到電極的量顯著提高，從而具有極強(qiáng)的雙氧水催化活性，因而放大了信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度。由于AgNCs納米線較強(qiáng)的放大效率，構(gòu)建的生物傳感器表現(xiàn)出較寬的線性范圍4.7×10-4.7×106 cfu mL-1和超高靈敏度，