褐藻多糖硫酸酯對人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、SPCA-1增殖的影響.pdf

1、目的:褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan),又稱為褐藻糖膠、巖藻聚糖硫酸酯、巖藻聚糖,是存在于所有褐藻中的細(xì)胞間多糖。它是一種水溶性雜多糖,除了主要成分L-巖藻糖和硫酸根外,還含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)等。本實驗所用褐藻多糖硫酸酯由市售裙帶菜(Undaria pinnatifida)中提取。研究表明,褐藻多糖硫酸酯具有多種生物學(xué)活性,包括較強的抗腫瘤活性,在體內(nèi)、體外實驗中,對多種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯的抑制增殖效應(yīng)。

2、具有廣泛的研究和開發(fā)應(yīng)用前景。大連地區(qū),褐藻類裙帶菜來源豐富、物美價廉、便于取材,具有明顯的地域優(yōu)勢。目前,裙帶菜仍然主要作為該地常見的食用藻類,有很大的開發(fā)利用和深加工的潛力和價值。
　　 肺癌是現(xiàn)代社會中,隨著環(huán)境壓力的加劇,嚴(yán)重威脅人類健康和生命的主要疾病之一。傳統(tǒng)的腫瘤治療均不可避免地對機體正常組織產(chǎn)生毒副作用。因此,尋找安全有效的抗腫瘤藥物成為腫瘤治療和藥物開發(fā)領(lǐng)域急待解決的一個方向,對促進人類健康具有重要意義。研究表

3、明,褐藻多糖硫酸酯對正常細(xì)胞的影響很小,安全性好,可望在腫瘤治療中發(fā)揮作用。本文旨在探討裙帶菜中褐藻多糖硫酸酯對人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、SPCA-1體外增殖的影響。
　　 方法:1.采用乙醇分級沉淀法、三氯乙酸除蛋白法從市售裙帶菜干粉中提取褐藻多糖硫酸酯;硫酸-苯酚法檢測所提樣品中的糖含量。
　　 2.MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法檢測褐藻多糖硫酸酯對A549及SPCA-1細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 3.Hoec

4、hst33258染色檢測經(jīng)褐藻多糖硫酸酯處理后A549細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)改變;免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測經(jīng)處理后A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9及核轉(zhuǎn)錄因子NF-kappa B的表達(dá)情況,并分別提取各組細(xì)胞的總蛋白,通過ELISA法對上述蛋白進行定量;流式細(xì)胞術(shù)檢測褐藻多糖硫酸酯對SPCA-1細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　 結(jié)果:1.提取所得多糖樣品的平均得率約為6.20％,樣品中平均糖含量約為40

5、.84%,Fucoidan的平均提取率約為2.53%。
　　 2.Fucoidan對A549細(xì)胞處理組與對照組間及不同濃度組間吸光度值均有顯著差異(P＜0.05)。IC50反映當(dāng)細(xì)胞存活率為50%時,對應(yīng)的Fucoidan處理濃度。各處理時間組6h、12h、24h組IC50分別為14.77 mg/ml,8.46mg/ml,3.08mg/ml。
　　 Fuocidan對SPCA-1細(xì)胞12h、24h、48h、72h處理組組

6、與對照組間及不同濃度組間吸光度值均有顯著差異(P＜0.05)。各處理時間組,即12h、24h、48h、72h組IC50分別為19.18 mg/ml,9.58mg/ml,2.62mg/ml,11.61mg/ml。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示:Fucoidan呈時間劑量依賴方式上調(diào)調(diào)Caspase-3、Caspase-9蛋白的活性,伴隨NF-kappa B轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)。
　　 ELISA法結(jié)果顯示:各處理組與對照組

7、均有差異,P＜0.05,各處理組間呈劑量依賴性上調(diào)Caspase-3、9,呈劑量和時間依賴性下調(diào)NF-kappaB。而5mg/ml組對Caspase-3上調(diào)的時間依賴關(guān)系不顯著,2.5mg/ml組對Caspase-9上調(diào)的時間依賴性不顯著。
　　 流式細(xì)胞術(shù)對Fucoidan處理的SPCA-1細(xì)胞檢測的結(jié)果顯示:Fucoidan具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng),經(jīng)10mg/ml Fucoidan處理12h后,凋亡率達(dá)37.78%,處理24

8、h凋亡率為18.4%。Fucoidan對細(xì)胞周期的影響結(jié)果顯示:與對照組相比G2/M期細(xì)胞比例下降,12h對照組為9.16%,5mg/ml組為6.8%,10mg/ml組未檢出G2/M期細(xì)胞。24h對照組為7.37%,5mg/ml組為0.38%,10mg/ml組為4.7%。
　　 結(jié)論:1.綜合分析選擇、改良方法,降低了Fucoidan對細(xì)胞作用的IC50值。
　　 2.Fucoidan對人肺腺癌細(xì)胞A549、SPCA-1