可注射光固化水凝膠用于局灶性角膜損傷修復(fù)的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　為了改善角膜供體嚴(yán)重缺乏的現(xiàn)狀，本研究希望通過(guò)組織工程的方法尋找一種生物材料來(lái)作為角膜替代材料，用于局灶性損傷角膜的結(jié)構(gòu)修復(fù)和視力恢復(fù)。明膠是一種天然生物材料，具有良好的生物相容性，分別通過(guò)丙烯酸酸酐和半胱胺進(jìn)行改性，使其具有光固化的特性。將水凝膠前驅(qū)體填補(bǔ)局灶性角膜缺損處，再用特定波長(zhǎng)的紫外光輻射固化，從而原位修復(fù)受損角膜。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　明膠（GE）與丙烯酸酸酐（AA）反應(yīng)生成GE-AA，GE

2、與半胱胺反應(yīng)生成GE-SH，對(duì)產(chǎn)物GE-AA和GE-SH進(jìn)行核磁共振氫譜（1H NMR）分析，判斷接枝成功與否，并分別計(jì)算接枝率。通過(guò)改變 GE-AA/GE-SH的比例、紫外光強(qiáng)度與前驅(qū)體固含量來(lái)合成不同性能的水凝膠，再對(duì)合成的水凝膠進(jìn)行流變學(xué)分析、掃描電子顯微鏡（SEM）分析、透光率測(cè)定、溶脹率測(cè)定和體外降解性能測(cè)定，來(lái)分析不同條件下合成的水凝膠的不同理化性質(zhì)。通過(guò) CCK-8體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、死活細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞追蹤實(shí)驗(yàn)，來(lái)研究

3、該水凝膠的體外生物相容性。通過(guò)3mm角膜環(huán)鉆移除新西蘭白兔角膜特定區(qū)域的上皮和基質(zhì)來(lái)構(gòu)建角膜局灶性缺損模型，將滅菌處理后的水凝膠前驅(qū)體填補(bǔ)缺損組織并用365nm紫外光進(jìn)行原位固化。通過(guò)裂隙燈觀察眼前節(jié)炎癥反應(yīng)和角膜修復(fù)情況；通過(guò)角膜光學(xué)相干斷層掃描（OCT）來(lái)觀察角膜預(yù)后及眼底狀況，評(píng)估該水凝膠是否有助于促進(jìn)角膜損傷修復(fù)及該植入方法是否對(duì)眼底有損害；通過(guò)角膜內(nèi)皮鏡檢查來(lái)觀察紫外光輻射對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)的影響，從而評(píng)估該水凝膠及其植

4、入方法是否對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞有損害。通過(guò)水凝膠合成、理化性能分析、體外生物相容性實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物體內(nèi)角膜修復(fù)實(shí)驗(yàn)這一系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)GE-AA/GE-SH水凝膠是否有助于局灶性角膜損傷修復(fù)作出結(jié)論。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　AA與GE在PH值為7.4～8.0的條件下可反應(yīng)生成GE-AA；半胱胺與GE在PH值為4.0～6.0的條件下，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（EDC）和N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS）催化下，反應(yīng)生成G

5、E-SH。通過(guò)改變GE-AA/GE-SH的比例、紫外光強(qiáng)度與前驅(qū)體固含量可以獲得不同機(jī)械性能的水凝膠，同時(shí)通過(guò)固含量的改變還能夠調(diào)整水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)、透光性能、溶脹性能和降解性能，其中固含量是對(duì)水凝膠理化性能影響最大的因素。通過(guò)表征實(shí)驗(yàn)，我們確定GE-AA/GE-SH水凝膠是一種高分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表面和內(nèi)部遍布直徑100～200μm的孔道，允許水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)透過(guò)，有利于為活細(xì)胞的生命活動(dòng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)；該水凝膠透光率大于90％，將其作為角膜損

6、傷修復(fù)材料應(yīng)用于眼表對(duì)角膜的透光性影響??；良好的溶脹性能使其具有很高的吸水性，有利于觸感的柔軟舒適和氧透過(guò)率的提高；良好的降解性能有利于角膜自身組織生長(zhǎng)和替代水凝膠材料，最終達(dá)到角膜組織再生的目的。體外生物相容性實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)該水凝膠對(duì) L929小鼠成纖維細(xì)胞的影響。CCK-8體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，L929細(xì)胞能在該水凝膠表面粘附生長(zhǎng)、分裂增殖，在7d內(nèi)無(wú)毒性反應(yīng)與異常表現(xiàn)；死活細(xì)胞染色和細(xì)胞追蹤實(shí)驗(yàn)表明，L929細(xì)胞被包載入該水凝膠、接受

7、365nm波長(zhǎng)、100 mW/cm2光強(qiáng)紫外輻射2min后，7d內(nèi)大部分L929細(xì)胞仍然能夠在水凝膠支架內(nèi)遷移、增殖、生長(zhǎng)，保持活力。最后將該水凝膠原位填補(bǔ)角膜缺損，裂隙燈觀察結(jié)果表明該水凝膠能夠促進(jìn)角膜上皮的生長(zhǎng)、角膜組織的修復(fù)；OCT檢查顯示該水凝膠能在一定程度上減少瘢痕的形成，對(duì)眼底組織無(wú)顯著影響；角膜內(nèi)皮鏡檢查表明紫外光輻射對(duì)角膜內(nèi)皮無(wú)明顯影響，動(dòng)物眼壓基本保持穩(wěn)定。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　GE-AA/GE-SH可注射