湖北地區(qū)雞毒霉形體的分離鑒定及分子流行病學(xué)研究.pdf

1、雞毒霉形體(Mycoplasma gallisepticum)在雞群中可引起嚴(yán)重的慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease,CRD)。該病在國內(nèi)雞群中非常普遍,可導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋率下降,肉雞出欄期延長。一旦和新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、大腸桿菌等病原發(fā)生協(xié)同感染,則可引起較高的發(fā)病率和死亡率。目前,我國針對雞毒霉形體的鑒定主要是采用病原分離培養(yǎng)及血清學(xué)鑒定等方法,但由于這些傳統(tǒng)方法既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力,因此無法滿足臨

2、床快速診斷的要求。而且,針對湖北地區(qū)家禽養(yǎng)殖場(戶)的雞毒霉形體流行現(xiàn)狀、耐藥性和病原性的相關(guān)研究尚無系統(tǒng)報(bào)道。鑒于此,本課題擬選用16S-23S rRNA基因間隔序列(intergenic spacer regions,ISR)對湖北地區(qū)雞毒霉形體流行毒株進(jìn)行研究,該段序列兼有保守性和突變性的特點(diǎn),既可滿足對雞毒霉形體臨床感染的快速診斷,也可用于對其分子流行病學(xué)和病原學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)分析。
　　 本研究應(yīng)用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)和鑒定技

3、術(shù),結(jié)合限制性酶切長度多態(tài)性分析技術(shù),對湖北地區(qū)流行的M.gallisepticum野毒株進(jìn)行了分離鑒定和耐藥性分析,建立了針對M.gallisepticum16S-23S rRNA ISR PCR快速檢測技術(shù),并進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查和病原性研究。具體研究成果如下。
　　 1、雞毒霉形體的分離鑒定及分離菌株的耐藥性分析在湖北地區(qū)47個(gè)養(yǎng)殖場(戶)共采集病樣172份,經(jīng)分離培養(yǎng)獲得77株疑似霉形體分離物,進(jìn)一步采用生化試驗(yàn)和代謝

4、抑制試驗(yàn)進(jìn)行鑒定,其中57株代謝抑制價(jià)在1:80以上,并采用16S rRNAPCR技術(shù)進(jìn)一步檢測,均擴(kuò)增出186bp大小的特異性條帶,鑒定為雞毒霉形體,陽性檢出率為33.1％,；另20株為非雞毒霉形體,有待進(jìn)一步鑒定。從各養(yǎng)殖場分離的雞毒霉形體分離株中選取部分菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn),結(jié)果表明大部分臨床分離株對泰妙菌素、吉它霉素和泰樂菌素高度敏感,而且分離自不同地區(qū)的分離株對抗菌藥物的敏感性存在一定差異。
　　 2、雞毒霉形體16

5、S-23S rRNA ISR PCR診斷方法的建立及分子流行病學(xué)研究以雞毒霉形體16S-23S rRNA.基因間隔區(qū)為目的基因,建立PCR檢測方法,對所有172份樣品進(jìn)行擴(kuò)增分析,結(jié)果從70份病料中擴(kuò)增出了850bp大小的特異性條帶,其中包括57株經(jīng)傳統(tǒng)技術(shù)鑒定為陽性的病樣,其陽性檢出率為40.7％。同時(shí)采用該P(yáng)CR方法及對上述分離獲得的20株非雞毒霉形體分離物進(jìn)行分析,初步鑒定為家禽霉形體。因此,針對16S-23S rRNA基因間隔區(qū)

6、建立的雞毒霉形體PCR檢測方法比傳統(tǒng)技術(shù)具更高的敏感性。隨后,將RFLP技術(shù)和PCR技術(shù)結(jié)合起來,采用限制性內(nèi)切酶RsaⅠ對PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析,根據(jù)酶切圖譜可將所有分離菌株分為兩個(gè)譜系(R1和R2)。同時(shí),結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查,R2基因型比R1基因型的菌株更為流行,且未見同一個(gè)場內(nèi)同時(shí)發(fā)生兩種基因型菌株感染的情況。進(jìn)一步對分離株165-235 rRNA基因間隔區(qū)進(jìn)行序列比對和進(jìn)化分析,來自各不同養(yǎng)殖場的分離菌株可歸為

7、三個(gè)亞群,有的菌株與參考株S6株為同一亞群,有的與F株為同一亞群,而參考株R株則獨(dú)自成一個(gè)亞群。
　　 3、湖北地區(qū)雞毒霉形體分離株致病性研究根據(jù)上述進(jìn)化分析結(jié)果,選擇在進(jìn)化樹上分別與S6和F株親緣關(guān)系較近的XA41株和ML21株作為研究對象,以S6和F株作為參考菌株,分別對4周齡雛雞進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),8天后以新城疫弱毒苗(Ⅳ系)進(jìn)行激發(fā)感染。結(jié)果接種S6和XA41株的實(shí)驗(yàn)動物全部發(fā)病,有明顯的呼吸道癥狀；通過剖檢肉眼觀察、組織學(xué)病

8、理切片和電鏡觀察,發(fā)病動物主要以上呼吸道病理變化為主；經(jīng)血清學(xué)檢測,抗體陽性反應(yīng)；S6和XA41株引起的氣囊損傷程度分別為3和2.8；S6和XA41株對雞胚致死率均為80％。而攻F株和ML21株的實(shí)驗(yàn)動物未出現(xiàn)明顯臨床癥狀；通過剖檢肉眼觀察、病理切片和電鏡觀察,各部位均無明顯病變；氣囊損傷程度均為0；抗體檢測為陰性；F株和ML21株對雞胚的致死率均為40％。表明XA41株和S6致病性相似,為強(qiáng)毒株；ML21株和F株相似,為弱毒株。因此,