4個WiniSTR位點的遺傳學調(diào)查.pdf

1、目的：DNA的短串聯(lián)重復序列(STR)，由于其高度的遺傳多態(tài)性和方法的簡便性，在法醫(yī)學方面成為主流的研究技術(shù)，特別是親權(quán)鑒定和個人識別方面。正因為STR的廣泛應(yīng)用也暴露出缺陷，其中之一便是在微量物證及腐敗檢材方面的局限性。因為目前的CODIS系統(tǒng)中STR片段均大于200bp，在DNA含量很少的檢材內(nèi)很難有如此完整的大片段以供擴增，所以減小目標片段的大小，而又不影響其核心序列的擴增，理論上便能增加微量物證的DNA擴增效率，這就是設(shè)計Min

2、iSTR位點的意義。MiniSTR即在STR擴增時將引物的設(shè)計更靠近核心重復序列的側(cè)翼序列，使整個擴增產(chǎn)物的大小僅在150kb左右，這樣就會降低DNA提取的難度，提高DNA的檢出率。因為其核心序列并未改變，所以MiniSTR位點依舊保持了STR片段的遺傳多態(tài)性，具有STR的全部優(yōu)點。在2001年911事故時，已有將MiniSTR位點引用于個人識別，突出了其小片段的優(yōu)勢。而MiniSTR基因座已被歐洲D(zhuǎn)NA分型工作組(EDNAP)定義為新

3、一代的遺傳標記物。而在06年，美國AB公司推出了商業(yè)的MiniSTR試劑盒minifiler，其中包括了性別基因在內(nèi)的9個CODIS系統(tǒng)內(nèi)位點，但因為CODIS系統(tǒng)位點有限，而且大部分不適宜重新設(shè)計引物，所以開發(fā)CODIS系統(tǒng)外的位點成為研究的重點。我國也有了CODIS系統(tǒng)外位點的相關(guān)研究，而在河北，湖南等地的研究表明地區(qū)差別明顯，所以不同地區(qū)的非CODIS系統(tǒng)調(diào)查有必要性，目前尚缺乏重慶地區(qū)的相關(guān)研究。為了給國產(chǎn)試劑盒的研究提供基礎(chǔ)，

4、對D1S1627，D2S441，D10S1248，D22S1045的4個MiniSTR基因座進行3色熒光標記，并制作相應(yīng)的等位基因分型標準物，進行本地區(qū)的遺傳學的相關(guān)調(diào)查。
　　方法：采用chelex100的方法提取170份重慶地區(qū)無關(guān)的健康個體全基因組DNA，將PCR的擴增體系為10μ L，將反應(yīng)體系中的引物濃度、Mg2+濃度，循環(huán)數(shù)，退火溫度，dNTP，DNA TAq酶都進行優(yōu)化找出最適合的反應(yīng)條件，然后再用聚丙烯酰胺凝膠電泳

5、(PAGE)分離擴增產(chǎn)物后銀染，選擇適合的等位基因后將凝膠內(nèi)的DNA回收，將回收物純化后再次擴增，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗和測序，按照國際法庭血液遺傳學會(ISFH)推薦的命名方式將其命名，將通過調(diào)整其濃度使電泳圖上得峰高達到一致。將實驗室自制的等位基因標準物進行樣本的遺傳學研究。然后用TAMRA、6-FAM、HEX分別標記引物D10S1248，D2S441和D1S1627，D22S1045的上游引物的5’端。將自制的等位基因標準物和

6、引物一起在ABI公司的3130測序儀上面電泳，進行基因分型分析。
　　結(jié)果：復合擴增結(jié)果，10μL的復合擴增：10×PCR緩沖液：1μ1，1mmol/L：MgCl2:0.6μ1，25mmol/L；dNTP：1μ1，2.5mmol/L；D2S441，D1S1627上、下游引物各0.20μ l，10μ mol/L；D10S1248，D22S1045上、下游引物各0.30μ l，10μ mol/L，Taq DNA聚合酶0.15μl，L(

7、5U/μl)，模板DNA1μ l(1ng/μ L)，滅菌雙蒸水2.55μ l。PCR擴增參數(shù)：熱循環(huán)參數(shù)為95℃：預(yù)變性3M，變性94℃：30S，退火59℃：30S，延伸72℃：60S，32個循環(huán)，72℃：15M。4個基因座分別檢出6，9，9，9個等位基因和107種基因型，其基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。其中D1S1627，D2S441，D10S1248，D22S1045基因座在重慶漢族群體的雜合度分別依次為0.81