集胞藻PCC6803--Ω-PpetE-petH的構(gòu)建及其強(qiáng)化輔酶NADPH再生的研究.pdf

1、輔酶NADPH對(duì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)以及其他還原性物質(zhì)的生產(chǎn)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。光合作用再生輔酶NADPH的過程中，鐵氧還蛋白-NADP+還原酶(FNR)是其關(guān)鍵酶。通過強(qiáng)化FNR表達(dá)，促進(jìn)其催化輔酶再生效率，對(duì)胞內(nèi)還原反應(yīng)及工業(yè)生物技術(shù)有重要的理論意義和參考價(jià)值。本文首先構(gòu)建了過量表達(dá)FNR的工程藍(lán)藻集胞藻PCC6803∷Ω-PpetE-petH，并進(jìn)一步研究FNR過量表達(dá)促進(jìn)輔酶NADPH再生的效率，以及利用集胞藻PCC6803∷Ω-Pp

2、etE-petH促進(jìn)NADPH再生在藍(lán)藻催化前手性羰基化合物不對(duì)稱還原合成手性醇中的應(yīng)用。
　　首先，從集胞藻PCC6803中克隆出編碼FNR的基因petH，利用限制性內(nèi)切酶和同源重組酶將petH插入含有啟動(dòng)子PpetE和終止子Ω的質(zhì)粒pHB1524上，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pHB1524-petH。再以pHB1524-petH為模板，通過PCR擴(kuò)增得到Ω-PpetE-petH片段，利用同源重組酶將Ω-PpetE-petH插入集胞藻PCC

3、6803的通用整合平臺(tái)pKW1188質(zhì)粒上，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pKW-Ω-PpetE-petH。利用EcoRⅠ酶切及基因測(cè)序，鑒定得到含啟動(dòng)子PpetE、終止子Ω和petH基因的重組質(zhì)粒pKW-Ω-PpetE-petH。
　　通過同源重組技術(shù)把調(diào)控FNR表達(dá)的目的基因片段整合到集胞藻染色體中構(gòu)建工程藍(lán)藻。通過自然轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pKW-Ω-PpetE-petH轉(zhuǎn)化進(jìn)集胞藻PCC6803，利用重組質(zhì)粒上攜帶的集胞藻PCC6803 slr

4、0168基因的同源序列，將Ω-PpetE-petH片段通過同源重組整合到集胞藻slr0168基因內(nèi)，構(gòu)建了過量表達(dá)FNR的工程藍(lán)藻:集胞藻PCC6803∷Ω-PpetE-petH。觀察到Ω-PpetE-petH片段的插入對(duì)集胞藻PCC6803生長(zhǎng)沒有影響。提取集胞藻的總膜蛋白，利用SDS-PAGE檢測(cè)到集胞藻PCC6803∷Ω-PpetE-petH中的FNR蛋白表達(dá)量得到了提高，進(jìn)一步證明成功構(gòu)建了銅離子誘導(dǎo)FNR過量表達(dá)的集胞藻PCC

5、6803∷Ω-PpetE-petH。
　　研究過量表達(dá)FNR的集胞藻PCC6803∷Ω-PpetE-petH促進(jìn)輔酶NADPH的再生效率，以及其在催化前手性羰基化合物不對(duì)稱還原合成手性醇中的應(yīng)用。結(jié)果表明，在銅離子濃度為320 nmol/L時(shí)，與野生型集胞藻PCC6803比較，集胞藻PCC6803∷Ω-PpetE-petH胞內(nèi)FNR酶活提高了40.74％，胞內(nèi)輔酶NADPH含量提高了80.75％;利用集胞藻PCC6803∷Ω-Pp

6、etE-petH催化苯乙酮不對(duì)稱還原生成S-苯基乙醇，反應(yīng)產(chǎn)率與集胞藻PCC6803比較提高了61.2％，反應(yīng)時(shí)間縮短了兩天;催化乙酰乙酸乙酯還原生成3-羥基丁酸乙酯，反應(yīng)產(chǎn)率與集胞藻PCC6803比較提高了36.36％。這表明FNR的過量表達(dá)可促進(jìn)輔酶NADPH再生，并提高了不對(duì)稱還原催化效率。
　　本文通過同源重組技術(shù)構(gòu)建了過量表達(dá)FNR的工程藍(lán)藻，相比于常規(guī)的載體表達(dá)目的基因，能夠達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)效果。本研究為促進(jìn)輔酶NA