當(dāng)歸多糖對(duì)輻射損傷小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞氧化損傷及凋亡影響的研究.pdf

1、電離輻射作用于機(jī)體可誘發(fā)大量自由基產(chǎn)生，而自由基作用于DNA、RNA等生物大分子，可致使其結(jié)構(gòu)改變和生物活性喪失，從而造成機(jī)體發(fā)生氧化損傷。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一種普遍存在于微生物及動(dòng)植物中的金屬酶，它可以催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，清除自由基，從而保護(hù)受損細(xì)胞，并對(duì)機(jī)體的氧化及抗氧化平衡起著非常重要的作用。丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)是過(guò)氧化脂質(zhì)的降解產(chǎn)物，通

2、過(guò)檢測(cè)MDA的含量可以判斷脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度，從而間接反應(yīng)細(xì)胞損傷情況。
　　細(xì)胞凋亡(apoptosis，AP)是指細(xì)胞在受到某些因素刺激或接受某種信號(hào)后的一種主動(dòng)的，由大量凋亡相關(guān)基因相互作用的細(xì)胞消亡的過(guò)程。它是一個(gè)多因素參與的、復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。電離輻射所致細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路主要有：依賴于DNA損傷、依賴于胞質(zhì)電離損傷、依賴于質(zhì)膜損傷和SAPK/JNK4種。P53、Bcl-2、Caspase-3在電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)

3、程中發(fā)揮著重要作用。電離輻射誘發(fā)細(xì)胞凋亡是通過(guò)P53依賴的方式來(lái)誘導(dǎo)死亡受體Fas及其配體FasL的表達(dá)。Bcl-2是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因研究中最被關(guān)注的蛋白質(zhì)之一，在輻射損傷中其主要作用是抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中極其重要的執(zhí)行分子之一，它能夠剪切細(xì)胞凋亡過(guò)程中的許多非常關(guān)鍵地蛋白，其激活通常需要從無(wú)活性的全長(zhǎng)Caspase-3(35KD)的Asp28和Ser29之間及Asp175和Ser176之間進(jìn)行剪切

4、，產(chǎn)生有活性的亞基(17KD和12KD)，其激活常被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)非常重要的指標(biāo)。
　　骨髓對(duì)電離輻射高度敏感。骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrowmononuc lear cell，BMNC)主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。輻射損傷可使BMNC數(shù)量減少，細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞發(fā)生氧化損傷及凋亡等。
　　當(dāng)歸多糖(angelica polysaccharides，APS)是傳統(tǒng)補(bǔ)血活血中藥--當(dāng)歸的主要活性成分之一。研究表明

5、：它具有影響造血系統(tǒng)、抗輻射、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒及調(diào)節(jié)免疫等功能。目前，APS抗輻射的具體機(jī)制并不十分明確。本實(shí)驗(yàn)是在建立C57BL/6小鼠急性放射損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，研究APS對(duì)急性放射損傷小鼠BMNC氧化損傷及細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討APS抗輻射的分子機(jī)制，為輻射保護(hù)劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　目的：研究APS對(duì)急性放射損傷小鼠BMNC氧化損傷、增殖能力、細(xì)胞凋亡率以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而了解APS抗輻射的分

6、子機(jī)制。
　　方法
　　1.C57BL/6小鼠隨機(jī)分為10組，正常組(不作任何處理)；生理鹽水(normal saline，NS)組、2 mg/kg APS組和8 mg/kg APS組，后3組根據(jù)時(shí)間點(diǎn)分別再分為第1d、3 d、7d組，共計(jì)9組。此9組小鼠采用直線加速器X線全身均勻照射，總劑量為4.0 Gy，時(shí)間1.25min，吸收劑量率3.76Gy/min，焦點(diǎn)距鼠100 cm，面積約25×25 cm2。照射后于3 h內(nèi)腹

7、腔分別注射NS、2 mg/kg APS和8 mg/kg APS，連續(xù)注射7d(每天注射一次，注射前稱重，根據(jù)小鼠體重分別計(jì)算出相應(yīng)注射體積)，于照射后第1、3、7d處死小鼠，常規(guī)方法提取其BMNC。
　　2.比色法檢測(cè)各組小鼠BMNC的SOD活性及MDA含量。
　　3.流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)各組小鼠BMNC細(xì)胞周期。
　　4.FCM檢測(cè)各組小鼠BMNC凋亡率。
　　5.FCM檢測(cè)各

8、組小鼠BMNC Bcl-2的表達(dá)率。
　　6.免疫細(xì)胞化學(xué)法和蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)各組小鼠BMNC P53的表達(dá)。
　　7.WB檢測(cè)各組小鼠BMNC Caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)小鼠急性放射損傷模型的建立：造模成功后NS組小鼠表現(xiàn)為飲水量增加，進(jìn)食量減少，偶有腹瀉、血便；皮毛略顯凌亂，易脫落；活動(dòng)顯遲緩，嗜睡，小鼠之間相互靠攏。各APS治療組小鼠上述癥狀相對(duì)

9、減輕。
　　2.APS對(duì)放射損傷后小鼠BMNC SOD活性及MDA含量的影響：照射后第1、3、7 d NS組與正常組相比，BMNC的SOD活性顯著降低、MDA含量明顯升高(P<0.05)；2 mg/kgAPS組和NS組同一時(shí)間點(diǎn)比較BMNCSOD活性增加，MDA含量降低，但差異均無(wú)顯著性(P>0.05)；8 mg/kgAPS組較NS組同一時(shí)間點(diǎn)比較，BMNC的SOD活性顯著增加(P<0.05)，但仍低于正常組，MDA含量顯著降低(

10、P<0.05)，但仍高于正常組。
　　3.APS對(duì)放射損傷后小鼠BMNC周期(G0/G1期)改變的影響：照射后第1、3、7 d NS組BMNC停滯于G0/G1期，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2 mg/kg APS組與NS組(1、3 d)比較，其G0/G1期比例有所下降，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)；2 mg/kg APS組(7d)及8 mg/kg APS組與NS組同一時(shí)間點(diǎn)比較，G0/G1期比例顯著性降低(P<

11、0.05)，但仍高于正常組。
　　4.APS對(duì)放射損傷后小鼠BMNC凋亡率的影響：照射后第1、3、7 dNS組BMNC的凋亡率均較正常組顯著增高(P<0.05)；2 mg/kg APS組BMNC凋亡率較NS組在照射后第1d、3d有所下降，但差異不顯著(P>0.05)；2 mg/kg APS組(7d)及8 mg/kg APS組與NS組同一時(shí)間點(diǎn)比較，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，但仍高于正常組。
　　5.APS對(duì)放射損傷

12、后小鼠BMNC Bcl-2蛋白表達(dá)率的影響：照射后第1、3、7 d NS組BMNC的Bcl-2表達(dá)率均較正常組顯著降低(P<0.05)；2 mg/kg APS組BMNC Bcl-2表達(dá)率較NS組在照射后第1 d、3 d有所升高，但差異不顯著(P>0.05)；2 mg/kg APS組(7d)及8 mg/kg APS組與NS組同一時(shí)間點(diǎn)比較，Bcl-2表達(dá)率升高顯著(P<0.05)，但仍低于正常組。
　　6.APS對(duì)放射損傷后小鼠BM

13、NC P53蛋白表達(dá)的影響：免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：正常組小鼠BMNC不表達(dá)P53，NS組、2 mg/kg APS、8 mg/kgAPS組P53的表達(dá)率明顯升高，但上述三組各時(shí)間點(diǎn)間表達(dá)均無(wú)顯著差異。WB結(jié)果顯示：照射后第1、3、7 d NS組8MNC的P53均較正常組顯著增高(P<0.05)；2 mg/kg APS組與NS組同一時(shí)間點(diǎn)相比，P53蛋白的表達(dá)有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；8 mg/kg APS組與NS組同一

14、時(shí)間點(diǎn)相比，P53蛋白的表達(dá)降低明顯(P<0.05)。
　　7.APS對(duì)放射損傷后小鼠BMNC Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響：正常組的Caspase-3未被激活，只表達(dá)全長(zhǎng)片段(35KD)，不表達(dá)激活片段(12+17KD)。照射后NS組各時(shí)間點(diǎn)與正常組比較，Caspase-3的全長(zhǎng)片段表達(dá)較顯著降低、激活片段表達(dá)顯著增加(P<0.05)；2 mg/kgAPS組與NS組同一時(shí)間點(diǎn)相比，全長(zhǎng)片段表達(dá)有所增加，激活片段表達(dá)有所降

15、低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)：8 mg/kg APS各組與NS組同一時(shí)間點(diǎn)相比，全長(zhǎng)片段表達(dá)增加、激活片段表達(dá)降低(P<0.05)。
　　結(jié)論：APS不僅能提高輻射損傷小鼠BMNC的SOD活性，降低其MDA含量；它還能減輕細(xì)胞周期阻滯、減少細(xì)胞凋亡率、降低P53總蛋白及Caspase-3激活片段表達(dá)、升高Bcl-2表達(dá)率，從而對(duì)輻射損傷小鼠具有保護(hù)作用。8 mg/kg APS組與2 mg/kg APS組相比，抗輻射效果更