川芎嗪對軟骨細(xì)胞活性及CDK4、CyclinD1影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:取30只新西蘭大白兔的膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,通過檢測軟骨細(xì)胞增殖活性及CDK4、CyclinD1的表達(dá)差異,探討川芎嗪對軟骨細(xì)胞生長周期的作用,為川芎嗪防治骨性關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.運(yùn)用膠原蛋白酶獲取軟骨細(xì)胞,構(gòu)建軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　 2.熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法(四甲基偶氮唑鹽比色法)檢測軟骨細(xì)胞生長曲線。
　　 3.取生長良好第2代軟骨細(xì)胞,隨

2、機(jī)分為空白對照組和不同濃度的3個實(shí)驗(yàn)組,并將每組分為24h、48h、72h組,運(yùn)用MTT法檢測川芎嗪對軟骨細(xì)胞活性的影響,運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測軟骨細(xì)胞周期。
　　 4.運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測軟骨細(xì)胞中CyclinD1、CDK4的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系:細(xì)胞接種24h后開始貼壁,增大,伸長形成突起;培養(yǎng)4d,可見細(xì)胞成簇現(xiàn)象,以梭形或橢圓形生長,且出現(xiàn)重疊生長現(xiàn)象;8

3、d左右,細(xì)胞增殖逐漸融合形成單層,呈不規(guī)則立體“鋪路石”樣。
　　 2.軟骨細(xì)胞生長曲線:第2代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)2～4d增殖活躍,5～7d增殖曲線逐漸平緩,8d后曲線開始略有下降。
　　 3.川芎嗪對軟骨細(xì)胞活性的影響:干預(yù)24h、48h、72h,各組軟骨細(xì)胞OD值逐漸增加,干預(yù)24h各組細(xì)胞OD值無明顯差異;干預(yù)48h實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞OD值明顯高于對照組(P=0.036,P=0.023);干預(yù)72h實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組

4、細(xì)胞0D值顯著高于對照組(P=0.008,P=0.004),干預(yù)72h實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組細(xì)胞OD值明顯高于實(shí)驗(yàn)1組(P=0.038,P=0.020)。
　　 4.川芎嗪對軟骨細(xì)胞增殖周期的影響:干預(yù)24h,各組細(xì)胞周期分布無明顯差異;干預(yù)48h,實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組G0/G1期明顯低于同期對照組(P=0.026,P=0.024),S期明顯高于同期對照組(P=0.040,P=0.025),PI明顯高于同期對照組(P=0.026,P=

5、0.024);干預(yù)72h,實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組G0/G1期顯著低于同期對照組(P=0.003,P=0.002),G2/M期明顯高于同期對照組(P=0.022,P=0.014)、實(shí)驗(yàn)1組(P=0.025,P=0.016),PI明顯高于同期對照組(P=0.003,P=0.002)
　　 5.各組細(xì)胞CyclinD1、CDK4mRNA的表達(dá)差異:干預(yù)第2代軟骨細(xì)胞24h、48h、72h后,各組CyclinD1、CDK4mRNA均有表達(dá),

6、干預(yù)24h各組無明顯差異;干預(yù)48h、72h實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組CyclinD1mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P=0.038,P=0.021;P=0.013,P=0.018);干預(yù)48h、72h實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組CDK4mRNA表達(dá)明顯高于對照組(P=0.023,P=0.020:P=0.034,P=0.017),干預(yù)72h實(shí)驗(yàn)2組、實(shí)驗(yàn)3組CDK4mRNA表達(dá)明顯高于實(shí)驗(yàn)1組(P=0.043,P=0.022)。
　　 結(jié)論: