利用褐菖鲉肝MT和HSPs的LAMP技術(shù)監(jiān)測海洋重金屬污染.pdf

1、目前我國對海洋環(huán)境中重金屬污染的監(jiān)測仍然是以化學(xué)分析為主，化學(xué)分析方法雖然能對環(huán)境或生物體內(nèi)重金屬含量進(jìn)行精確的定量，但無法反映污染物的生物效應(yīng)，也難以了解污染物對海洋生態(tài)系統(tǒng)造成的破壞程度，很難評估其潛在毒性。因此篩選出與環(huán)境污染物相關(guān)性好的分子生物標(biāo)志物，并建立特異性強(qiáng)、微量鑒定、費(fèi)用低廉的快速檢測方法具有良好的應(yīng)用前景和效益。
　　 本研究以靈敏度高、特異性強(qiáng)的海洋重金屬污染生物標(biāo)志物—MT為指標(biāo)，克隆了褐菖鲉(Sebas

2、tiscus marmoratus)的MT基因序列，建立并優(yōu)化了針對MT的LAMP技術(shù)。為驗(yàn)證該方法的可行性，將褐菖鲉分別曝露于1.6μg·L-1、8.0μg·L-1、40μg·L-1、200μg·L-1、500μg·L-1的Cd和Pb7d后，利用LAMP技術(shù)和Realtime-PCR技術(shù)定量測定肝臟MT mRNA表達(dá)量，對比驗(yàn)證兩者結(jié)果。同時利用LAMP技術(shù)對污染后HSPs(HSP60、HSC70、HSP70、HSP90)基因的表達(dá)量

3、進(jìn)行檢測，分析Cd和Pb與HSPs各亞型的劑量-效應(yīng)關(guān)系，篩選出重金屬污染的早期預(yù)測指標(biāo)。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)建立并優(yōu)化了褐菖鲉MT的LAMP檢測技術(shù)，結(jié)果表明，外引物與內(nèi)引物濃度比為1∶6時擴(kuò)增效果最好，最佳Mg2+濃度為6 mmol·L-1，甜菜堿最佳濃度為0.4 mol·L-1，最佳dNTP濃度為1.4 mmol·L-1，最適反應(yīng)溫度為64℃，最佳反應(yīng)時間為60 min。
　　 (2) Cd、Pb污染實(shí)

4、驗(yàn)表明，利用LAMP技術(shù)定量測定褐菖鲉肝臟MT表達(dá)量與Real-time PCR檢測結(jié)果有高度的一致性，證實(shí)了LAMP技術(shù)應(yīng)用于重金屬污染樣品檢測的可行性。且LAMP技術(shù)具有反應(yīng)速度快、設(shè)備簡單、結(jié)果易于鑒定等Real-time PCR無法比擬的優(yōu)勢，更適合作為海洋重金屬污染的現(xiàn)場監(jiān)測方法。
　　 (3)褐菖鲉肝臟MT對不同濃度Cd和Pb污染的響應(yīng)趨勢大不相同。MT對Cd污染較敏感，在8.0μg·L-1濃度組被強(qiáng)烈誘導(dǎo)且mRNA

5、表達(dá)量達(dá)到最大值，為對照組的12.27倍，其余各濃度組與對照組無顯著性差異，表明MT可以作為Cd污染早期預(yù)測指標(biāo)。MT對Pb污染較不敏感，40μg·L-1濃度組之前隨濃度的增加mRNA表達(dá)量逐漸下降，而后逐漸上升，在500μg·L-1組達(dá)到最大值，但所有濃度組與對照組均無顯著性差異。
　　 (4)采取LAMP技術(shù)檢測Cd與Pb污染后HSPs的表達(dá)量表明，HSPs對單一重金屬的不同濃度以及不同重金屬的響應(yīng)趨勢各異，總體對Cd比Pb

6、敏感。對Cd污染早期就比較敏感的基因有HSC70和HSP70，較低濃度組誘導(dǎo)下HSC70和HSP70的表達(dá)量均上升，HSP70上升顯著，為對照組的54.07倍;HSP60和HSP90在低濃度誘導(dǎo)下上升不顯著或被抑制，在污染高濃度組表達(dá)量上升，分別在8.0μg·L-1和40μg·L-1達(dá)到最大值。對Pb污染早期比較敏感的基因?yàn)镠SC70和HSP90，在1.6μg·L-1濃度組，這兩種基因的表達(dá)量均被誘導(dǎo)，HSP90上升顯著(P=0.003