毛細(xì)管區(qū)帶電泳法快速分離珠蛋白肽鏈及其應(yīng)用研究.pdf

1、目的：
　　血紅蛋白病是一類(lèi)由珠蛋白結(jié)構(gòu)異?；蛘吆铣刹蛔阋鸬倪z傳性疾病，主要分為地中海貧血（簡(jiǎn)稱(chēng)“地貧”）和異常血紅蛋白。地貧主要是因?yàn)橹榈鞍谆虍惓＃怪榈鞍纂逆満铣墒艿揭种贫鴮?dǎo)致類(lèi)α肽鏈和類(lèi)β肽鏈?zhǔn)Ш獾囊唤M遺傳性溶血性疾病。根據(jù)α-和β-鏈?zhǔn)Ш獬潭瓤煞譃橐韵氯?lèi):（一）地貧基因攜帶者，此類(lèi)個(gè)體常無(wú)明顯的臨床癥狀。α-地貧基因攜帶者基因型多為-α/αα，ααT/αα，αTα/αα，-α/-α，-α/α Tα;β-地貧基因攜帶者

2、常見(jiàn)基因型為β+/βN，β0/βN。（二）中間型地貧:該型臨床表型嚴(yán)重程度不同，貧血程度也有很大差別。中間型α-地貧又稱(chēng)Hb H病，此類(lèi)患者基因型多為--/-α或--/α Tα。而中間型β-地貧患者的基因型多為β+/β+，β+/β0，β-地貧復(fù)合HPFH，δβ-地貧。（三）重型地貧:該型包括重型α-地貧和重型β-地貧。由于重型α-地貧四個(gè)α-珠蛋白基因缺如，γ-珠蛋白相對(duì)過(guò)剩，聚集產(chǎn)生Hb Bart's(γ4)γ又稱(chēng)Hb Bart's胎

3、兒水腫綜合征，其基因型為--/--。重型β-地貧的基因型為β0/β+，β0/β0。異常血紅蛋白則是因?yàn)橹榈鞍祖湹姆肿咏Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)、功能、合成和/或穩(wěn)定性產(chǎn)生改變的一組遺傳性疾病。
　　表型研究在異常血紅蛋白疾病的診斷以及病情預(yù)判中占有重要的地位?，F(xiàn)階段用于地中海貧血和異常血紅蛋白輔助診斷的臨床表型研究指標(biāo)有平均紅細(xì)胞體積(MCV)，平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)，異常的HbA2、 HbF含量以及異常血紅蛋白的檢

4、出。盡管如此，由于表型與基因關(guān)系的復(fù)雜性加大了研究的困難，因此聯(lián)合各種表型檢查技術(shù)輔助診斷地貧是很有必要的。為了更好的理解地貧，揭示α/非α鏈不平衡的程度，確定未知異常血紅蛋白和監(jiān)測(cè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)珠蛋白基因療法的血液學(xué)研究，珠蛋白鏈的成份分析和結(jié)構(gòu)鑒定研究就尤為重要。迄今為止，已報(bào)道有多種方法用于珠蛋白肽鏈分析，包括酶聯(lián)免疫法測(cè)定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，凝膠電泳，高效液相色譜

5、法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和反相高效液相色譜法（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）。但是這些方法仍然面臨操作繁瑣，樣品制備耗時(shí)和分辨率有限等缺點(diǎn)。最近，毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)技術(shù)因其高效率，低樣品消耗，分析時(shí)間短，溶劑消耗少和分離能力高

6、等優(yōu)勢(shì)正在成為人類(lèi)珠蛋白鏈分離有吸引力的工具之一。在毛細(xì)管應(yīng)用研究中一些研究人員主要集中于探討涂層毛細(xì)管在珠蛋白鏈的分離和定量中的應(yīng)用。然而，商業(yè)性涂層毛細(xì)管因其昂貴的費(fèi)用，使用的有限性以及復(fù)雜費(fèi)時(shí)的處理過(guò)程限制了它在臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)在酸性條件下使用未涂層毛細(xì)管，以動(dòng)態(tài)涂層替代永久性涂層同樣可以獲得良好的分離效果。盡管目前出現(xiàn)了基于該法的分析條件，卻并沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用。在實(shí)際應(yīng)用中，我們?nèi)悦媾R許多問(wèn)題，例如:如何簡(jiǎn)化復(fù)雜的

7、處理過(guò)程;如何提高實(shí)驗(yàn)效率獲得高的分辨率等。毛細(xì)管分離性能的提高和條件的優(yōu)化可能是兩個(gè)主要的思考方向。另外一個(gè)需要面臨的問(wèn)題是，目前所報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)中的方法條件均有所不同，找到其中的共同規(guī)律對(duì)于有此類(lèi)需求的工作而言顯然具有重要意義。
　　本研究的主要目的是基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)建立一種快速珠蛋白肽鏈分離方法，并探討該法在提示異常血紅蛋白病的臨床應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為相關(guān)工作提供有益的經(jīng)驗(yàn)。
　　方法：
　　1.樣本收集:在本

8、研究中，選取20例樣本（每種類(lèi)型地貧各4例）用于前期分離方法的建立和實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。另選4個(gè)樣品（正常的成人，正常新生兒，Hb H病，中重型β-地貧）分別平行測(cè)定5次用來(lái)評(píng)估該實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。另外，共收集了310例臨床樣本，其中正常樣本58例，α-靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型共107例，Hb H病39例，β-地貧攜帶者43例，中重型β-地貧63例。樣本首先進(jìn)行血液學(xué)表型分析初篩:血常規(guī)（重要指標(biāo):MCV、MCH），血紅蛋白篩查（異常血紅蛋白HbE、Hb

9、H等的檢出，HbA2）;在血液學(xué)指導(dǎo)下進(jìn)行分子診斷，常見(jiàn)α-地貧缺失突變選用多重Gap-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)、常見(jiàn)α-地貧和β-地貧點(diǎn)突變選用反向點(diǎn)雜交(Reverse Dot Blot，RDB)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）方法的建立:總結(jié)相關(guān)參考文獻(xiàn)，采用國(guó)產(chǎn)未涂層石英毛細(xì)管(70 cm×50μm)，電泳緩沖液為100 mM磷酸二氫鈉水溶液，工作溫度

10、25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。首先用正常成人、正常新生兒、Hb H病以及中重型β-地中海貧患者血液樣本作方法建立、初步進(jìn)行珠蛋白肽鏈分離以及條件優(yōu)化。采用以下方式預(yù)處理進(jìn)樣樣品:25μl抗凝血經(jīng)0.9％生理鹽水洗滌3次后，溶于1ml去離子超純水，低速離心后取上清。參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇pH＜3進(jìn)行篩選并優(yōu)化電泳條件;觀察不同分離電壓、pH、溫度以及波長(zhǎng)對(duì)電泳分離行為的影響并進(jìn)行重復(fù)性評(píng)價(jià)。
　　3.應(yīng)用研究:對(duì)58例正常成人樣本，107

11、例α-地貧靜止型/標(biāo)準(zhǔn)型，39例Hb H病，43例β-地貧攜帶者，63例β-地貧中重型通過(guò)該方法檢測(cè)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；谡＝M與各病例組統(tǒng)計(jì)比較結(jié)果(SPSS13.0)，用受試者工作特征曲線(ROC)分析α/β對(duì)于β-地貧攜帶者、Hb H病的篩查效率，經(jīng)比較優(yōu)選最佳截?cái)嘀?通過(guò)使用雙變量相關(guān)分析計(jì)算斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)來(lái)確定β-地貧中重型樣品中γ/α面積比和HbF的水平之間的關(guān)聯(lián)程度。另外用所建立方法分析常見(jiàn)異常血紅蛋白。
　　結(jié)果：

12、
　　經(jīng)篩選得到最優(yōu)電泳條件如下:25μl的全血用生理鹽水洗滌3次除去血漿。洗滌后的紅細(xì)胞用1ml去離子水作溶血處理。溶血產(chǎn)物4000 r/min離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片后壓力進(jìn)樣（3秒）。采用國(guó)產(chǎn)未涂層石英毛細(xì)管70 cm（總長(zhǎng)）×50um（內(nèi)徑），分離電壓19 KV，UV檢測(cè)，設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm;電泳緩沖液采用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L磷酸二氫納，三氟乙酸調(diào)節(jié)pH至2.14），0.25％PEG-6000作動(dòng)態(tài)涂層

13、。在此電泳條件下，pre-β，β，α，γ在17min內(nèi)被很好分離。同一樣品連續(xù)五次進(jìn)樣，各成分保留時(shí)間變異系數(shù)(CV)為0.37-1.69％，峰面積CV為0.46-6.71％，證實(shí)此法的穩(wěn)定性較好。降低pH可使電泳出峰峰圖更尖銳，分辨率增高，然而對(duì)珠蛋白肽鏈保留時(shí)間的影響則并不顯著。低pH環(huán)境(＜3)主要可減少石英管壁對(duì)蛋白質(zhì)的吸附。同時(shí)極端pH環(huán)境以及高濃度磷酸緩沖液直接使血紅蛋白四聚體解聚離解鏈成α-和β-珠蛋白鏈并保持單鏈狀態(tài)。在

14、儀器有效范圍內(nèi)，增大分離電壓可有效提升分離速度，使峰型更加尖銳，分辨率增高，但是相應(yīng)的兩成分之間的有效分離距離將會(huì)縮小，產(chǎn)生部分重疊。溫度亦是可影響分離行為的重要因素之一，實(shí)驗(yàn)表明升高溫度可以減少肽鏈遷移時(shí)間，然而在高溫環(huán)境下異常峰的出現(xiàn)會(huì)干擾肽鏈的分析，且分離基線隨著溫度升高變得不穩(wěn)定。以上結(jié)果提示在儀器有效范圍內(nèi)可通過(guò)增大分離電壓或升高溫度來(lái)提高分析效率，但增大分離電壓可使分辨率下降，升高分離溫度可使分離基線不穩(wěn)定，因此，在實(shí)際工作

15、中需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整。
　　統(tǒng)計(jì)比較結(jié)果提示，α/β在正常與其他各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。但正常組與α-地貧靜止型/標(biāo)準(zhǔn)型組、β-地貧攜帶者組均值差異不大，可能是因?yàn)檎Ｖ榈鞍祖湵磉_(dá)補(bǔ)償性增高或多余的肽鏈的降解而導(dǎo)致?；谇绊?xiàng)分析結(jié)果，我們采用ROC曲線分析α/β比值對(duì)于提示Hb H病、中重型β-地貧診斷有重要意義，前者敏感性為100％，特異性為97.4％，后者特異性敏感性均達(dá)100％。通過(guò)對(duì)52例β-

16、地貧中重型病人HbF值與γ/α面積比值做分析，顯示兩者之間有較高相關(guān)性（R2=0.8318，P＜0.01），進(jìn)一步提示了毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)珠蛋白肽鏈分析方法的可行性。另外，7例Hb WS和2例Hb G-Honolulu均被準(zhǔn)確篩查出，但同樣常見(jiàn)于中國(guó)人群的Hb CS和Hb QS用本法卻未能檢測(cè)出，可能是因?yàn)镠b CS和Hb QS不穩(wěn)定容易降解所致或是本法的敏感性不足以檢測(cè)出這兩種異常血紅蛋白。
　　結(jié)論：
　　α-，β-和γ-