化學(xué)-生物選擇性稀土元素標(biāo)簽和蛋白摶元素質(zhì)譜絕對(duì)定量.pdf

1、作為蛋白質(zhì)組研究的重要組成部分,定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究對(duì)于我們了解生命系統(tǒng)動(dòng)態(tài)而又復(fù)雜的運(yùn)行過(guò)程具有重要意義?；诜肿淤|(zhì)譜的蛋白質(zhì)定量技術(shù)雖然在蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量中得到廣泛的應(yīng)用,但是,隨著生命科學(xué)的發(fā)展,蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量已經(jīng)難以滿(mǎn)足要求,發(fā)展蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量技術(shù)已迫在眉睫。電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)由于具有高靈敏度、寬的動(dòng)態(tài)范圍、同一元素的不同形態(tài)具有相同的信號(hào)響應(yīng)等優(yōu)點(diǎn),使它在蛋白質(zhì)絕對(duì)定量研究領(lǐng)域顯示出很大的潛力。已有的基

2、于ICP-MS的蛋白質(zhì)定量研究表明,通過(guò)蛋白質(zhì)分子中內(nèi)生的的S、P和Se以及各種金屬元素,或者通過(guò)人工標(biāo)記的外源:Hg、Ⅰ和鑭系等元素,都可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量,其中稀土元素以其極高的靈敏度和眾多可選元素/同位素的等特點(diǎn)顯示出最大的潛力。由于基于ICP-MS的蛋白質(zhì)定量策略需要保證金屬標(biāo)記蛋白質(zhì)的單一性,而目前的分離技術(shù)無(wú)法對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)組的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行完全分離。因此在本論文中,我們將以發(fā)展特異性的稀土標(biāo)簽核心,降低對(duì)色譜/電泳分離的

3、依賴(lài),使得利用ICP-MS對(duì)實(shí)際蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行定量成為可能,具體的研究工作將在本博士論文中一一闡述。本論文主要包括以下六個(gè)部分的內(nèi)容:
　　 第一章主要對(duì)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組的相關(guān)背景知識(shí)進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹,回顧和概述了近幾年來(lái)基于分子質(zhì)譜和ICP-MS的蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)、策略和發(fā)展趨勢(shì)。
　　 第二章以雙功能稀土螯合配體MMA-DOTA為橋梁,通過(guò)對(duì)標(biāo)記條件的優(yōu)化,成功實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島素(insulin),核糖核酸酶A(ribo

4、nuclease A)和溶菌酶(lysozyme)上的所有巰基的完全稀土標(biāo)記,結(jié)合HPLC/SUID-ICP-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)這3個(gè)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量,并證明對(duì)完整蛋白質(zhì)進(jìn)行稀土標(biāo)記與定量的可行性。
　　 第三章主要是以一種絲氨酸蛋白酶抑制劑4-2-胺乙基苯磺酰氟(4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride,AEBSF)為基礎(chǔ),通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)(clickchemistry)合成Eu標(biāo)記的活性蛋白特

5、異性標(biāo)簽(Europium-Labeled Activity-BasedProbe),成功地對(duì)多肽/蛋白質(zhì)混合物中兩種絲氨酸蛋白酶(serine proteases,SPs),即胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)和彈性蛋白酶(elastase)進(jìn)行特異性、完全稀土標(biāo)記,結(jié)合HPLC/SUID-ICP-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)這2個(gè)模型SPs的絕對(duì)定量。進(jìn)一步將這一技術(shù)應(yīng)用于人體血漿,以及雄性大鼠組織中活性SPs的研究,結(jié)果表明這一技術(shù)不僅可

6、以評(píng)估蛋白酶抑制劑的水平,還能夠?qū)ι锝M織中的差異表達(dá)SPs進(jìn)行絕對(duì)定量。
　　 第四章結(jié)合光可裂解稀土標(biāo)記酶活性標(biāo)簽、點(diǎn)擊反應(yīng)與納米技術(shù),我們建立了一種集SPs的標(biāo)記、純化、富集與定量于一體的多功能活性蛋白質(zhì)分析平臺(tái)(multifunctional active protein assay platform,MAPAP)。初步研究表明,MAPAP在生理?xiàng)l件下具有良好的穩(wěn)定性,在紫外光的照射下可以發(fā)生快速的光裂解。
　　

7、 第五章,利用蛋白酶專(zhuān)一性酶切多肽底物的原理,我們構(gòu)建了稀土編碼多肽納米粒子(Lanthanide-coded Peptide-Specifc Nanoparticle,LnPeNP)探針用于蛋白質(zhì)的非標(biāo)記檢測(cè)分析。由于ICP-MS可以分辨各種稀土元素,極大地降低光譜重疊的影響,因此可以根據(jù)目標(biāo)蛋白酶對(duì)應(yīng)的不同底物,設(shè)計(jì)合適的LnPeNP標(biāo)簽用于多種目標(biāo)蛋白酶的高靈敏度同時(shí)定量檢測(cè)。我們以trypsin和chymotrypsin為模型蛋