ADSCs在組織工程化軟組織當(dāng)中的應(yīng)用與研究.pdf

1、1、目的：
　　 隨著在組織工程技術(shù)及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，組織工程技術(shù)在角膜、肝、胰、軟骨、骨、血管、尿道、神經(jīng)系統(tǒng)等領(lǐng)域均取得了巨大的成就，而組織工程技術(shù)在整形外科的應(yīng)用還處于起步階段。具有“主動(dòng)修復(fù)功能”和“可調(diào)控生物響應(yīng)特性”的第三代含有干細(xì)胞的復(fù)合組織材料成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)和未來(lái)的發(fā)展方向。然而，目前含有干細(xì)胞的復(fù)合組織材料仍有很多問(wèn)題尚未解決，如復(fù)合組織材料在組織修復(fù)再生過(guò)程中與宿主間相互作用的機(jī)理尚不清楚。材料在體內(nèi)的轉(zhuǎn)

2、歸、對(duì)宿主局部微環(huán)境及全身防御和再生體系的影響尚不確定等。上述問(wèn)題極大地阻礙了復(fù)合組織材料的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。
　　 本實(shí)驗(yàn)以脂肪來(lái)源干細(xì)胞(Adipose-derivedstemcellsADSCs)為種子細(xì)胞，以可以注射的游離脂肪顆粒、透明質(zhì)酸凝膠（hyaluronicacidHA）為細(xì)胞支架材料，構(gòu)建含有干細(xì)胞的復(fù)合組織材料。通過(guò)研究含有干細(xì)胞的復(fù)合組織材料在組織修復(fù)再生過(guò)程中與宿主的相互作用，闡明復(fù)合組織材料在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸、對(duì)宿

3、主微環(huán)境及全身的影響，揭示復(fù)合組織材料與宿主相互作用的調(diào)控機(jī)制;建立新型復(fù)合組織材料的篩選、研發(fā)的理論體系和關(guān)鍵技術(shù)，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　 2、方法：
　　 2.1、脂肪來(lái)源干細(xì)胞的分離提取培養(yǎng)及鑒別
　　 1)ADSCs分離，脂肪組織來(lái)源于整形外科脂肪抽吸病人，患者自愿捐獻(xiàn)自體脂肪組織用于本次試驗(yàn)。2）膠原酶消化法提取脂肪來(lái)源性干細(xì)胞，分離、收集原代ADSCs按4×105有核細(xì)胞/ml細(xì)胞密度接種于培

4、養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，常用的75mm塑料培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞，加入低糖DMEM+10％FBS完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。用胰酶消化傳代，收集第3代細(xì)胞作為種子細(xì)胞和檢測(cè)對(duì)象。3）流式細(xì)胞儀測(cè)定干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD49、CD105等，該方法僅用以證明該細(xì)胞群有干細(xì)胞特性，不影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 2.2、細(xì)胞—生物支架復(fù)合物取材、制備和植入:
　　 以脂肪顆粒和透明質(zhì)酸為支架材料，和種子細(xì)胞混合制成細(xì)胞-生物支架復(fù)合物，本次實(shí)驗(yàn)共分5組:組①

5、以ADSCs為種子細(xì)胞按25×106個(gè)/ml濃度與純化后的脂肪顆粒1∶1等體積混合配置成ADSCs+游離脂肪顆粒復(fù)合物;組②以單純ADSCs為一組，將ADSCs配置成濃度為12.5×106個(gè)/ml懸液備用;組③以單純純化過(guò)的脂肪顆粒為一組;組④ADSCs按25×106個(gè)/ml濃度與醫(yī)用透明質(zhì)酸以1∶1等體積混合;組⑤單純透明質(zhì)酸組;。按每組0.2ml注射至裸鼠(12只，5W雄性)背部皮下，形成5個(gè)點(diǎn)，每組各1個(gè)點(diǎn)，觀察裸鼠植入后的生命體

6、征及局部炎癥反應(yīng)情況，3個(gè)月后取材，用于檢測(cè)與分析。將取材所獲得的新生組織分別從體積、質(zhì)量、組織學(xué)、mRNA表達(dá)、Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行研究。
　　 3、結(jié)果：
　　 本次試驗(yàn)12只裸鼠局部植入填充物后生命體征平穩(wěn)，每只裸鼠注射部位均未見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，組①、②、③、④均可見(jiàn)有新生組織形成，組⑤未見(jiàn)新生組織形成。大體觀，組③、①可見(jiàn)明顯有黃色脂肪顆粒型成，組②、④未見(jiàn)明顯黃色脂肪脂肪顆粒，利用Masson三色染色染色

7、法可見(jiàn)①、②、③、④四個(gè)組中均可見(jiàn)脂肪細(xì)胞，及膠原蛋白，其中ADSCs+游離脂肪顆粒組中富含膠原及脂肪顆粒，且脂肪顆粒及膠原結(jié)締組織排列較規(guī)則，脂肪顆粒細(xì)胞大小不均勻，有新生脂肪顆粒細(xì)胞。單純ADSCs移植入組可見(jiàn)大量的膠原形成，無(wú)明顯成熟的脂肪顆粒細(xì)胞，排列紊亂，無(wú)明顯規(guī)律。透明質(zhì)酸+ADSCs組與單純ADSCs組接近，富含膠原蛋白排列有序，未見(jiàn)明顯成熟脂肪細(xì)胞，單純游離脂肪顆粒移植入組可見(jiàn)大量脂肪細(xì)胞形成，排列規(guī)律，大小均勻，膠原蛋

8、白形成相對(duì)較少。四組中體積組①＞組③＞組④＞組②，質(zhì)量組①＞組③=組④＞組②，組③與組④之間質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR示四組中均見(jiàn)到人類mRNA表達(dá)，提示新生組織來(lái)自植入的復(fù)合組織。Westernblot示四組中均可見(jiàn)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，其含量有組②≈組④＞組①＞組③的趨勢(shì)。
　　 4、結(jié)論：
　　 ADSCs其表面抗原較弱，不易產(chǎn)生抗原，不產(chǎn)生致熱源，局部注射產(chǎn)生炎癥反應(yīng)較輕，注射局部無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。ADSCs可