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文檔簡(jiǎn)介
1、腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)嚴(yán)重威脅人類的健康,具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)。為了提高ICH患者的臨床療效,重點(diǎn)在于更好地了解ICH后導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的機(jī)制。
健康的大腦擁有完整的血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB),T淋巴細(xì)胞幾乎不能遷移入腦實(shí)質(zhì);ICH發(fā)生后,白細(xì)胞等外周免疫細(xì)胞可以大量進(jìn)入腦實(shí)質(zhì),聚集在血腫的周圍,產(chǎn)生作用。在哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中,T淋巴細(xì)
2、胞對(duì)抗病原菌入侵中也起著核心的作用。而且越來(lái)越多的證據(jù)表明免疫炎癥反應(yīng)在ICH后的繼發(fā)性腦損傷中起著重要的作用。各種免疫活性成分如促炎細(xì)胞因子、補(bǔ)體、中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與腦出血后的繼發(fā)性損傷有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)性ICH中,腦內(nèi)白細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)引起的先天性免疫反應(yīng)已被證實(shí)。雖然不同的淋巴細(xì)胞亞群在腦缺血中強(qiáng)大的保護(hù)或損害作用已被闡明,但I(xiàn)CH中發(fā)生后顱內(nèi)浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞很少被關(guān)注。
姜黃素已被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)BBB
3、并在腦組織中保持較高的生物活性,它能有效的保護(hù)ICH后的BBB損傷,本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抑制脊髓損傷后的膠質(zhì)瘢痕形成和腦外傷的炎癥反應(yīng);同時(shí)也有研究表明它能抑制由不同的有絲分裂如ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖和差異性調(diào)節(jié)CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞應(yīng)答作用。因此,本研究的目的是了解ICH后腦內(nèi)浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞的變化規(guī)律和證實(shí)BBB的破壞可以促進(jìn)外周T淋巴細(xì)胞遷移入腦內(nèi)。此外,我們采用小鼠自體血ICH模型探討姜黃素治療能否減少腦浸潤(rùn)
4、T淋巴細(xì)胞的數(shù)量,從而改善神經(jīng)功能,進(jìn)而從某種程度上改善神經(jīng)炎癥。
一、腦出血后腦內(nèi)浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞隨時(shí)間的變化
目的:了解腦出血后的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的時(shí)間變化規(guī)律和探討B(tài)BB的破壞和T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。
方法:C57小鼠自體血注射制作腦出血模型。在ICH后的0、1、3、5、7、14天,挑選右側(cè)大腦半球(出血側(cè)),運(yùn)用特異的T淋巴細(xì)胞標(biāo)志物(CD45,CD11b,CD3,CD4,CD8),進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)
5、。BBB的分子機(jī)制緊密連接蛋白(claudin5、ZO-1、Occludin)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的蛋白表達(dá)運(yùn)用運(yùn)用Western blot進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)claudin5采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)。血腦屏障的通透性采用伊文思藍(lán)染料滲透分析。
結(jié)果:1、腦內(nèi)T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)在ICH后的第3天大量聚集在血腫周圍,第5天達(dá)到高峰;同時(shí)伊文思藍(lán)的通透和緊密連接蛋白的表達(dá)也有相似的結(jié)果。
2、在ICH后的第5天,同組小鼠的出
6、血側(cè)大腦的T淋巴細(xì)胞和MMP9的表達(dá)明顯高于未出血側(cè)。
結(jié)論:結(jié)果表明,腦浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞與ICH的發(fā)生擁有時(shí)間依賴性,ICH發(fā)生后,T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)在損傷側(cè)的大腦陽(yáng)性表達(dá)較明顯,且與BBB的破壞有關(guān)系。
二、姜黃素可降低腦出血后腦內(nèi)T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)
目的:探討姜黃素是否能夠降低實(shí)驗(yàn)性小鼠腦出血顱內(nèi)T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。
方法:小鼠隨機(jī)分為三組;對(duì)照組(sham組),腦出血+溶劑干預(yù)組(ICH+vehi
7、cle),腦出血+姜黃素治療組(ICH+Cur)。姜黃素溶于DMSO中,100mg/kg腹腔注射。對(duì)照組和腦出血+溶劑干預(yù)組注射相同體積的DMSO。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)出血側(cè)顱內(nèi)淋巴細(xì)胞的亞型及數(shù)量。免疫熒光技術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞和VCAM-1的表達(dá)。在腦出血72h后,神經(jīng)功能測(cè)評(píng)采用28分神經(jīng)功能評(píng)分、轉(zhuǎn)角試驗(yàn)和前肢放置試驗(yàn)。腦含水量用濕/干法進(jìn)行檢測(cè)。VCAM-1、IFN-γ和IL-17在腦內(nèi)得蛋白表達(dá)采用Western blot檢測(cè)。腦內(nèi)
8、血腫大小采用MRI測(cè)定。在腦出血后的第5天,BBB的分子機(jī)制緊密連接蛋白(claudin5、ZO-1、Occludin)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的蛋白表達(dá)運(yùn)用運(yùn)用Western blot進(jìn)行測(cè)定。血腦屏障的通透性采用伊文思藍(lán)染料滲透和熒光進(jìn)行分析。
結(jié)果:1、在ICH后72小時(shí),姜黃素治療可明顯改善神經(jīng)功能的缺損和降低腦水腫。
2、姜黃素可減少血腫周圍的T淋巴細(xì)胞的聚集,同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)姜黃素治療組也能明
9、顯的減少顱內(nèi)浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量
3、Western blot分析和免疫組織化學(xué)染色表明姜黃素治療可以顯著降低血管上VCAM-1的表達(dá),同時(shí)也減少了顱內(nèi)IFN-γ和IL-17的表達(dá)。
4.在ICH后的第5天,姜黃素能夠有效地保護(hù)BBB,并同時(shí)減少顱內(nèi)T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。
結(jié)論:本部分研究結(jié)果表明,姜黃素治療后可減輕ICH導(dǎo)致的腦組織炎癥和腦水腫,至少在一定程度上與顱內(nèi)T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)系;T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)與
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