A型流感病毒M2蛋白跨膜區(qū)抑制自噬體成熟.pdf

1、A型流感是由A型流感病毒引起的一種重要的人畜共患病，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，而且有些亞型流感病毒甚至突破種間屏障，具有了感染人的能力，對人類健康和發(fā)展也存在重大威脅。因此，研究病毒-宿主相互作用關(guān)系對發(fā)展有效抗病毒策略具有重要意義。病毒感染宿主涉及一系列復(fù)雜的生理生化過程，細胞自噬作為一種高度保守的細胞內(nèi)降解過程，在病毒感染過程中發(fā)揮著重要的抗病毒作用。細胞自噬除了能夠通過其吞噬作用直接參與病原體清除保護感染細胞外，還能介導(dǎo)與病原

2、體清除相關(guān)的先天性和適應(yīng)性免疫活動的發(fā)生，而病毒為自身存活在長期的進化過程中也具有了逃避宿主抗病毒自噬機制的能力。鑒于此，病毒感染和自噬之間的相互調(diào)控關(guān)系引起了越來越多人的關(guān)注。
　　流感病毒M2蛋白是由病毒第七節(jié)段編碼的一種跨膜蛋白，其離子通道活性可以促進病毒感染早期vRNP復(fù)合體從M1蛋白解離及釋放，并在病毒組裝和出芽過程中發(fā)揮重要作用。為進一步研究流感病毒M2蛋白與細胞自噬的相互作用關(guān)系，本實驗構(gòu)建了GFP-LC3和pCAF

3、-M2重組質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293T細胞，并通過激光共聚焦和western blot方法檢測M2轉(zhuǎn)染細胞自噬體水平。通過進一步的LC3-Ⅱ turnover試驗、mRFP-GFP-LC3雙熒光指示系統(tǒng)以及GFP-LC3與LAMP1的共定位觀察檢測細胞自噬流水平。結(jié)果表明，流感病毒M2蛋白能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)自噬體積累，而且M2蛋白是通過抑制自噬體與溶酶體融合誘導(dǎo)自噬體積累的。在自噬過程中，細胞內(nèi)可形成三種Beclin1復(fù)合體，作用于自噬不同階段

4、，其中Beclin1-UVRAG復(fù)合體介導(dǎo)自噬體與溶酶體融合。為探索M2蛋白是否是通過與Beclin1蛋白相互作用影響B(tài)eclin1-UVRAG復(fù)合體形成而抑制自噬體與溶酶體融合，本實驗構(gòu)建了自噬相關(guān)蛋白Beclin1和UVRAG的重組表達質(zhì)粒，并與M2重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，通過免疫共沉淀實驗研究三者之間的相互作用關(guān)系。結(jié)果表明Beclin1蛋白與M2蛋白存在相互作用，但梯度增加M2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量對Beclin1蛋白與UVRAG蛋白的相互

5、作用影響不明顯，說明M2蛋白抑制自噬體與溶酶體融合可能有其它機制存在。為進一步探索M2蛋白抑制自噬體成熟的作用機制，我們將M2蛋白進行截短表達和氨基酸缺失，并通過激光共聚焦和western blot方法檢測各截短表達體對自噬體水平的影響。將M2蛋白第35-45位氨基酸缺失后發(fā)現(xiàn)LC3點狀聚集現(xiàn)象明顯減弱，表明M2蛋白跨膜區(qū)35-45位氨基酸對M2蛋白抑制自噬體與溶酶體融合具有重要作用。將35-45位氨基酸分別單個缺失，發(fā)現(xiàn)缺失41位色氨