甘丙肽過表達基因片段的構(gòu)建及顯微注射.pdf

1、目的:為了在整體水平研究甘丙肽的功能，構(gòu)建了神經(jīng)特異表達甘丙肽過表達載體，并進行顯微注射以制作轉(zhuǎn)基因小鼠。由于在正常生理過程中，甘丙肽表達水平比較低，只有在某些病態(tài)下甘丙肽表達才會有異常的變化，故制作轉(zhuǎn)基因小鼠，以研究內(nèi)源性釋放的甘丙肽的功能及作用機制，為相關(guān)疾病提供新的治療線索。
　　 方法:首先提取C57BL/6J小鼠腦組織中總RNA和基因組DNA，分別以總RNA和DNA為模板，用RT-PCR技術(shù)獲得甘丙肽的cDNA編碼區(qū)，

2、再用PCR技術(shù)獲得甘丙肽5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)，然后用重疊延伸PCR技術(shù)連接上述片段，獲得甘丙肽目的基因，將目的基因上游插入PDGF β-鏈啟動子，將重組質(zhì)粒命名為PDGF-GAL；重組質(zhì)粒PDGF-GAL經(jīng)XbaⅠ、HindⅢ雙酶切，將連接有啟動子的甘丙肽基因片段回收純化后，用顯微注射法將甘丙肽基因注入受精卵的雄原核中，選取發(fā)育正常的受精卵移植到假孕母鼠的輸卵管壺腹部，待其產(chǎn)仔。
　　 結(jié)果:甘丙肽目的基因經(jīng)測序鑒定，與G