觀賞南瓜未受精子房、胚珠離體培養(yǎng)及其機(jī)理研究.pdf

1、南瓜(Cucurbita moschata D.)又名倭瓜,具有較高的觀賞及藥用保健價(jià)值。目前,我國(guó)觀賞類南瓜的育種理論及技術(shù)基礎(chǔ)相對(duì)滯后,導(dǎo)致優(yōu)良品種較少且品種更新速度慢。通過南瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的單倍體育種途徑,可以人工誘導(dǎo)南瓜的離體雌核發(fā)育,從而快速獲得單倍體以及雙單倍體植株,進(jìn)而迅速獲得純合的系統(tǒng),為觀賞類南瓜優(yōu)良自交系的選育提供有效的技術(shù)手段。未受精胚珠離體培養(yǎng)建立的再生體系也可以作為南瓜遺傳工程的理想受體系統(tǒng),使隱性基因得

2、以順利表達(dá)。
　　 本論文以“試驗(yàn)?zāi)瞎?號(hào)”為材料,通過對(duì)南瓜(Cucurbita moschata D.)未授粉子房和未受精胚珠的離體培養(yǎng),誘導(dǎo)了雌核發(fā)育,并獲得了染色體數(shù)減半的胚囊植株。并以MS為基本培養(yǎng)基,研究了黑暗熱激預(yù)處理時(shí)間、2,4-D濃度、激素組合、碳源種類和濃度等以及KT預(yù)處理和AgNO3刺激等因素對(duì)未受精胚珠誘導(dǎo)的影響；同時(shí),分別采用石蠟切片法和改良苯酚品紅壓片法觀察南瓜胚囊發(fā)育過程及根尖染色體,并利用抗微管除

3、草劑氟樂靈和秋水仙素對(duì)南瓜進(jìn)行了加倍誘導(dǎo)研究,旨在為建立高效的南瓜未授粉子房和未受精胚珠的培養(yǎng)技術(shù)和探討雌核發(fā)育的機(jī)理,為觀賞類南瓜單倍體培養(yǎng)奠定重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐支撐。研究結(jié)果如下:
　　 1.利用石蠟切片技術(shù)系統(tǒng)觀察了南瓜的子房胚囊發(fā)育過程。發(fā)現(xiàn)南瓜的子房胚囊發(fā)育時(shí)期為開花前3d至開花當(dāng)天,經(jīng)歷單核胚囊時(shí)期(開花前3d)、雙核胚囊時(shí)期(開花前2d)、四核胚囊時(shí)期(開花前1d)、成熟胚囊期(開花當(dāng)天),其中成熟胚囊期(七細(xì)胞

4、八核)胚囊為蓼型胚囊。同時(shí)發(fā)現(xiàn)開花當(dāng)天的未受精胚珠(成熟胚囊期)的胚狀體誘導(dǎo)率、成苗率均高于開花前1d和2d的未受精胚珠。
　　 2.黑暗熱激預(yù)處理?xiàng)l件下南瓜未受精離體雌核誘導(dǎo)效果較好,其中未受精子房培養(yǎng)以35℃條件下黑暗熱激處理6d為最佳,其出胚數(shù)和出胚率分別為4.8個(gè)、22％,與熱激5d、7d差異極顯著；不同胚囊時(shí)期間的誘導(dǎo)效果無差異。黑暗熱激處理5d條件下的未受精胚珠直接培養(yǎng)的轉(zhuǎn)綠率和胚狀體誘導(dǎo)率最高,分別達(dá)到了80％和1

5、5％以上。
　　 3.不同濃度的2,4-D對(duì)南瓜未受精子房離體誘導(dǎo)影響方面,較高的2,4-D濃度可有效地啟動(dòng)南瓜未受精子房的雌核發(fā)育,抑制南瓜未受精胚珠胚狀體的誘導(dǎo)；而低濃度(1.0、1.5 mg·L-1)的2,4-D能有效地誘導(dǎo)未受精胚珠的雌核發(fā)育。培養(yǎng)基中單獨(dú)添加2,4-D3.5、4.0和4.5 mg·L-1條件下均有效地刺激離體雌核的發(fā)育。其中2,4-D濃度為3.5 mg·L-1時(shí)三個(gè)胚囊時(shí)期的未受精子房離體誘導(dǎo)胚狀體率達(dá)

6、到最高,均在4.5％以上,其次為2,4-D4.5 mg·L-1和4.0 mg·L-1處理；三種胚囊時(shí)期中的開花前0.5d(12h)未受精子房在三種2,4-D處理?xiàng)l件下均誘導(dǎo)出子葉胚,其子葉胚數(shù)分別為4個(gè)、2個(gè)和1個(gè)。在2,4-D1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1條件下的南瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)綠率較高,而低濃度或高濃度2,4-D條件下其誘導(dǎo)率均較低。
　　 4.南瓜未受精子房離體培養(yǎng)需高濃度的2,4-D、

7、HAA和低濃度的6-BA處理:而低濃度的2,4-D、HAA和高濃度的6-BA處理可進(jìn)行未受精胚珠培養(yǎng)。其中未受精子房誘導(dǎo)胚狀體處理以4.0mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg.L-6-BA效果最佳；而南瓜未受精胚珠離體誘導(dǎo)以1.0 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-16-BA處理效果最好,其子葉胚數(shù)達(dá)到6個(gè)。
　　 5.蔗糖和葡萄糖均可作為南瓜未受精子房誘導(dǎo)雌核發(fā)

8、育的碳源,其中蔗糖的誘導(dǎo)效果好于葡萄糖。不同蔗糖濃度條件下30g·L-1處理的胚狀體誘導(dǎo)率最高,為8.52％；不同葡萄糖濃度處理下40g·L-1處理的胚狀體誘導(dǎo)率最高,為4.44％。不同蔗糖濃度條件下南瓜未受精胚珠誘導(dǎo)胚狀體效果以25g·L-1處理最好,其胚狀體誘導(dǎo)率為83.33％,子葉胚達(dá)到7個(gè)。
　　 6.南瓜未受精胚珠誘導(dǎo)胚狀體效果以MS+2,4-D1.0 mg·L-1+NAA0.25 mg·L-1+6-BA1.0 mg·

9、L-1+30g·L-1蔗糖+6g·L-1瓊脂處理較好,其胚狀體誘導(dǎo)率為3.3％。其分化、再生培養(yǎng)基分別以MS+30g·L-1蔗糖+6g·L-1瓊脂、MS+30g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂+1 g·L-1活性炭效果最佳,其胚狀體發(fā)育成正常植株率達(dá)70％以上。KT預(yù)處理及AgNO3處理均對(duì)未受精胚珠誘導(dǎo)胚狀體及再生植株均具有抑制作用。另外,AgNO3處理可促進(jìn)南瓜未受精胚珠分化不定芽,以16mg·L-1處理最佳。而KT預(yù)處理抑制南瓜未

10、受精胚珠的不定芽發(fā)生,特別對(duì)開花當(dāng)天的未受精胚珠抑制作用明顯,其發(fā)生率率僅為3.3％,但對(duì)其他兩個(gè)接種時(shí)期未受精胚珠的抑制作用稍減。同時(shí),試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不定芽生長(zhǎng)為正常植株比率較低,僅為0.3％～6.7％。
　　 7.南瓜未受精胚珠在誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生過程中IAA、ZR、GA3、ABA四種內(nèi)源激素含量變化大體表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)。但其出現(xiàn)峰值時(shí)間和增加幅度不同,內(nèi)源ABA和GA3出現(xiàn)峰值時(shí)間均為第30d,IAA為第40d,ZR含

11、量為第50d:ZR增幅為第10d含量的10.57倍,其次ABA和IAA分別為7.74、6.49倍,GA3增幅最小,僅為2.02倍。說明內(nèi)源IAA,ABA,ZR對(duì)體細(xì)胞胚的形成作用比較顯著。在分化培養(yǎng)時(shí)期,四種內(nèi)源激素含量總體變化是呈下降趨勢(shì)。無活性炭培養(yǎng)基中的培養(yǎng)材料的IAA、ABA含量高于有活性炭的培養(yǎng)基,而ZR,GA3含量低于有活性炭的培養(yǎng)基。在分化再生階段,四種內(nèi)源激素的含量處于低水平并呈下降趨勢(shì),說明較低水平的激素含量有利于體細(xì)

12、胞胚分化出苗。
　　 ABA/GA3、IAA/ZR、ABA/ZR三種比值中的ABA/ZR比值變化對(duì)體細(xì)胞胚成苗影響較大。
　　 8.南瓜未受精胚珠體細(xì)胞胚發(fā)生過程中,在誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)期可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先升后降的規(guī)律性變化,并在在培養(yǎng)第20d時(shí)出現(xiàn)峰值。在分化培養(yǎng)階段,無活性炭和有活性炭培養(yǎng)基中的可溶性蛋白含量也呈先升后降趨勢(shì),但出現(xiàn)高峰時(shí)間為第30d。
　　 9.利用改良苯酚品紅染色法觀察南瓜染色體數(shù)目,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)