根表多環(huán)芳烴降解細菌的分離篩選及其在植物根表的定殖和效能.pdf

1、多環(huán)芳烴(PAHs)是土壤環(huán)境中常見的一類持久性有機污染物。土壤中PAHs可通過揮發(fā)、光解、微生物降解等方式而去除，也可通過植物吸收積累作用而進入食物鏈，危害生態(tài)安全和人群健康。自然界中大部分細菌是以生物膜方式存在的，植物根表細菌生物膜可以減低土壤環(huán)境中污染物對植物的毒害作用并促進宿主植物生長。從植物根表篩選具有PAHs降解功能的細菌并將其定殖在植物根表，可在根表形成PAHs降解細菌生物膜;該生物膜對土壤中PAHs有阻隔和降解作用，這不

2、僅有望降低植物吸收積累PAHs的污染風險，還可提高根際土壤中PAHs的去除效率。
　　本研究從PAHs污染場地健康植物根表篩選獲得了兩株具有PAHs降解功能的細菌（以下簡稱功能細菌），鑒定了功能細菌的分類地位，并研究了其生長和降解特性;明確了不同環(huán)境條件對功能細菌降解PAHs的影響，優(yōu)化了菌株降解PAHs的環(huán)境條件;分別用抗生素抗性標記和綠色熒光蛋白基因（gfp）標記對功能細菌進行標記，將其定殖在植物根表，研究了功能菌株在植物根表

3、的定殖分布及其對植物吸收積累PAHs的影響;探討了表面活性劑作用下根表細菌生物膜對植物吸收積累PAHs的影響。主要研究成果如下:
　　(1)從PAHs污染區(qū)健康植物牛筋草(Eleusine indica(L.) Gaertn.）根表分離獲得了兩株分別具有菲和芘降解功能的細菌。經(jīng)生理生化測定及16S rRNA基因序列同源性分析，確定兩株菌分別為具有菲降解能力的Diaphorobacter sp.Phe15和具有芘降解能力的Mycob

4、acterium sp.Pyr9。優(yōu)化了兩株功能菌株降解PAHs的環(huán)境條件。其中，菌株Phe15降解菲的最適溫度為30℃，最適pH值為7.0～10.0，該條件下2d內(nèi)其對初始濃度為100 mg·L-1菲的降解率可達到97％以上。菌株Phe15對150 mg·L-1濃度范圍內(nèi)的菲都具有良好的降解效果，且隨著接種量的增加，降解逐漸加快。菌株Pyr9降解芘的最適溫度為30℃，最適pH值為7.0～8.0，該條件下10d能將初始濃度為50mg·L

5、-1的芘全部降解。芘濃度范圍為50～200 mg·L-1時，芘濃度越高，Pyr9對芘的降解率越低;供試接種量范圍內(nèi)(5～20％)，接種量越高，Pyr9對芘的降解越快。
　　(2)分別用抗生素抗性標記和綠色熒光蛋白基因（gfp）標記對功能細菌Phe15和Pyr9進行了標記，并將其定殖在植物根表，研究了功能菌株在植物根表的定殖分布及其對植物吸收PAHs的影響。其中，菌株Phe15對氨芐青霉素(75 mg·L-1)和低濃度的氯霉素(25

6、 mg·L-1)有抗性。利用這兩種抗性作為菌株Phe15的篩選標記，采用灌根和浸種兩種定殖方式將菌株Phe15定殖到三葉草根表。結果表明，菌株Phe15在植物根表的定殖促進了三葉草的生長，同時降低了菲在三葉草體內(nèi)的濃度和積累量。兩種定殖方式均可降低三葉草體內(nèi)菲含量，且灌根方式要優(yōu)于浸種。同時，兩種定殖方式都能夠提高污染土壤中菲的去除率，且灌根方式下土壤中菲去除率更高。
　　用綠色熒光蛋白基因（gfp）對菌株Pyr9進行了標記，標記

7、菌株（Pyr9-gfp）對芘的降解能力沒有顯著變化。掃描電子顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡照片表明，菌株Pyr9-gfp可以在三葉草根表定殖并形成細菌生物膜。采用灌根方式將Pyr9-gfp定殖在三葉草根表，定殖在根表的Pyr9-gfp可以進入植物根部組織，并在植物體內(nèi)增殖，且數(shù)量隨土壤中芘污染濃度的增加而增大。功能細菌Pyr9-gfp在三葉草根表的定殖可以顯著提高植物莖葉和根部生物量，降低植物體內(nèi)芘濃度、積累量及富集系數(shù)，同時顯著提高了土

8、壤中芘的去除率。
　　(3)向PAHs污染土壤中添加表面活性劑Tween80，探究了Tween80作用下菌株Pyr9在三葉草根表的定殖及其對植物吸收PAHs和根際PAHs去除的影響。供試Tween80濃度范圍（100～1000 mg·kg-1）內(nèi)，隨著Tween80濃度升高，三葉草體內(nèi)Pyr9的數(shù)量變化不明顯，植物根部和莖葉生物量先增加后減小，Tween80添加量為250mg·kg-1時，植物生物量最大。相同處理條件下，灌根組植物

9、生物量大于不接菌組，表明菌株Pyr9在植物根表的定殖促進了植物生長。100～1000 mg·kg-1Tween80促進了植物對芘的吸收。Tween80作用下，菌株Pyr9在三葉草根表的定殖同樣可以降低三葉草體內(nèi)芘含量。
　　添加Tween80增大了三葉草根際土壤中芘的去除率。添加量為0～500 mg·kg-1時，隨著Tween80添加量增加，土壤中芘的殘留量降低。同一Tween80添加量下，灌根組(CPR)土壤中芘含量顯著低于不接